鱖魚泛素活化酶、泛素結(jié)合酶基因的克隆、表達(dá)和功能.pdf

1、鱖魚(Siniperca chuatsi)是原產(chǎn)我國的淡水肉食魚類，具有較大經(jīng)濟(jì)價值，已經(jīng)成為我國重要的養(yǎng)殖品種。而近年來傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleenand kidney necrosis virus，ISKNV)對鱖魚養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了研究病毒與宿主的相互作用，本論文針對與蛋白降解相關(guān)的泛素-蛋白酶體降解途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)中的泛素活化酶(ubi

2、quitin activaingenzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)展開研究。 通過改良的簡并引物設(shè)計法，釣取出鱖魚細(xì)胞內(nèi)兩基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)。利用快速擴(kuò)增cDNA末端(rapid amplification ofcDNAends，RACE)技術(shù)，克隆得到了鱖魚E1、E2的全長cDNA序列。其中，E1的全長cDN

3、A含一個長達(dá)3174 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼1057個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為117975.77 Da，等電點(diǎn)為5.46。所獲取E2的全長cDNA含一個444 bp的開放閱讀框，編碼147個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為16546.04 Da，等電點(diǎn)為7.78，屬于UBC4/5家族成員，含有進(jìn)化保守的UBC結(jié)構(gòu)域。根據(jù)所得序列，應(yīng)用實(shí)時定量PCR技術(shù)，分析了E1、E2基因在健康鱖魚中的組

4、織分布，結(jié)果顯示E1和E2基因在被檢測的所有組織都有分布，均在血液中表達(dá)量最高，E1在腦中表達(dá)量最低，而E2在脾中表達(dá)量最低。進(jìn)行了鱖魚E2基因的原核表達(dá)。將E2的ORF克隆于pET-32a(+)、pMal-c2X、pGEX-4T-1三種原核表達(dá)載體并分別在大腸桿菌BL21(DE3)和XL1-Blue中成功地高效表達(dá)了目的蛋白，融合蛋白可溶性較好并通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)正確表達(dá)。為了進(jìn)一步研究E2蛋白的功能，采用經(jīng)典的體外泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其

5、活性。通過ISKNV所編碼的五個環(huán)指蛋白和此E2蛋白反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)65，66蛋白和它有較強(qiáng)作用；另外它還與鱖魚的一種含有HECT(homologous toE6-AP carboxyl terminus)結(jié)構(gòu)域的E3蛋白有較強(qiáng)的泛素化反應(yīng)。這些結(jié)果表明所獲得的鱖魚E2蛋白具有泛素結(jié)合酶的活性。這是在鱖魚中首次發(fā)現(xiàn)E1和E2基因，研究了它們在鱖魚中的組織分布情況，并首先證實(shí)了該E2蛋白具有泛素結(jié)合酶活性。本文為E1、E2以及UPP的進(jìn)一步研究