miR-675-5p在非小細胞肺癌中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景和目的:肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人的身體健康和生命安全。肺癌按組織學分類一般分為鱗癌、腺癌、大細胞癌和小細胞癌，其中前三種臨床常見并統稱為非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，約占全部肺癌的80％。肺癌患者早期一般無明顯癥狀，當確診時多數已經是肺癌晚期。近年，盡管以外科為主的綜合治療取得了長足的進步，但其5年存活率仍然不足15％。目前唯一能有效提高NSCL

2、C長期生存率的辦法就是做到早診斷早治療，而要做到早診斷，明確NSCLC發(fā)生、發(fā)展的分子機制有著至關重要的作用。
　　miRNAs是生物體內具有調控功能的一類非編碼RNA(長度大約19-24個核苷酸)，其主要通過與靶基因3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)結合，導致翻譯抑制或mRNA降解，從而調控靶基因的表達。大量研究表明多種腫瘤組織中存在miRNA異常表達且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，既可作為抑癌基因，下調原癌基因的活性;也可作為癌基

3、因，下調抑癌基因的活性。因此，其作為一類新的分子研究靶點已受到腫瘤等生物醫(yī)學研究領域極大關注。
　　由于RNA測序(RNA-seq)和miRNA芯片雜交方法的廣泛應用，許多惡性腫瘤的miRNA表達譜得以建立，其中一些miRNA已成為腫瘤治療的新靶點和預后的標志物。miRNA在NSCLC中的研究也越來越多，隨著研究的不斷深入，大量的miRNA在NSCLC中的作用得以明確。最近文獻報道m(xù)iR-675在人類神經膠質瘤、胃癌、肝癌等多種惡

4、性腫瘤組織中表達上調，且通過調控Cadherin13、RUNX1(Runt Domain Transcription Factor1)、Twist1(twist basichelix-loop-helix transcription factor1)等不同的靶基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展;而另有研究卻發(fā)現miR-675在腎上腺皮質癌組織中表達下調。提示不同的腫瘤中miR-675的表達及其作用存在不同。miR-675在NSCLC中的表達情況以及是

5、否影響其生物學特性和相關的作用機制至今未見文獻報告。本項目擬采用分子生物學、細胞生物學、免疫組織化學等方法分析miR-675-5p在NSCLC癌組織中的表達水平及其臨床病理意義;在此基礎上，進一步探討改變miR-675-5p的表達水平分析其對NSCLC細胞惡性生物學特征的影響以及在癌變作用的機制。為確立miR-675-5p作為抗NSCLC治療的新靶點及預后的分子標志物提供科學依據。
　　方法:1.收集35例臨床資料齊全NSCLC病

6、人標本（癌組織與配對癌旁組織），實時熒光定量PCR檢測miR-675-5p在NSCLC癌組織及配對癌旁組織中的表達水平，分析miR-675-5p表達與NSCLC患者臨床病理特征的相關性。
　　2.構建LV-miR-675-precursor和LV-miR-675-5p-inhibition慢病毒載體并包裝制備病毒（隨機任意序列為陰性對照），感染NSCLC細胞A549和HTB-182，獲得miR-675-5p穩(wěn)定表達上調和下調細胞株

7、，分析上調和下調miR-675-5p的表達對A549和HTB-182細胞生長增殖、侵襲遷移以及裸鼠移植成瘤等生物學方面的影響。
　　3.生物信息學預測miR-675-5p靶基因，構建含靶基因3'-UTR的熒光素酶報告質粒，脂質體轉染A549細胞和HTB-182細胞并檢測其熒光素酶活性;Western雜交檢測上調和下調miR-675-5p后A549和HTB-182細胞中靶基因GPR55表達水平，免疫組織化學檢測上調miR-675-5

8、p后A549細胞成瘤體后組織中GPR55表達，確定 miR-675-5p是否直接作用于預測靶基因GPR55的3'-UTR且影響其表達。
　　4、非小細胞肺癌及肺正常組織芯片，免疫組織化學分析靶基因GPR55蛋白在NSCLC中的表達水平及與淋巴結轉移的關系。
　　5.構建siRNA-GPR55干擾質粒轉染細胞株A549-LV-miR-675-5p-inhibition，進一步分析敲降靶基因GPR55后是否阻斷或降低miR-67

9、5-5p下調對NSCLC細胞A549生長增殖、侵襲遷移以及裸鼠成瘤促進作用。
　　結果:1.miR-675-5p在非小細胞肺癌的癌組織中平均表達水平與其配對的癌旁組織相比明顯下調（P＜0.05），且與淋巴結轉移、TNM分期成負性相關;與永生化的人正常支氣管上皮細胞HBE相比，miR-675-5p在6株NSCLC細胞中的表達也明顯下調（P＜0.05）。
　　2.建立miR-675-5p穩(wěn)定表達上調細胞株(A549-LV-miR

10、-675-precursor及HTB-182-LV-miR-675-precursor)和miR-675-5p穩(wěn)定表達下調細胞株(A549-LV-miR-675-5p-inhibition及HTB-182-LV-miR-675-5p-inhibition)，下調miR-675-5p的表達，體外可顯著促進NSCLC細胞A549和HTB-182的生長增殖、克隆形成、侵襲遷移，體內可促進移植裸鼠成瘤的生長（P＜0.05）;上調miR-675-

11、5p的表達則顯著抑制NSCLC細胞生長增殖、侵襲遷移以及裸鼠移植瘤的生長(P＜0.05)。
　　3.雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示GPR55是miR-675-5p的直接作用靶基因，上調或下調miR-675-5p表達可以導致GPR55蛋白表達水平下調或上調。
　　4.與永生化的人正常支氣管上皮細胞HBE相比，GPR55在6株NSCLC細胞中的表達明顯上調;與肺正常組織相比，GPR55蛋白在NSCLC組織中表達顯著上調(P＜0.

12、05)，且與腫瘤的淋巴結轉移成相關。
　　5.下調A549-LV-miR-675-5p-inhibition細胞GPR55表達后，可顯著阻斷miR-675-5p下調對A549細胞生長增殖、侵襲遷移及裸鼠移植瘤瘤體生長的促進作用，進一步證實miR-675-5p調控靶基因GPR55表達參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。
　　結論:1.miR-675-5p在NSCLC組織中的表達水平下調且與淋巴結轉移、TNM分期成負相關。
　　2.上