調(diào)控SIRT1-ARE-NRF2信號(hào)通路對(duì)PQ中毒小鼠肺損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:氧化應(yīng)激在百草枯（paraquat, PQ）中毒發(fā)病機(jī)制中的作用已得到廣泛認(rèn)同，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子參與PQ肺損傷的病理生理過程。研究其調(diào)節(jié)方式及機(jī)制將有助于深化對(duì)PQ中毒發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。積累的資料表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1，Sirt1)可通過多種途

2、徑調(diào)節(jié)抗氧化分子的表達(dá)，并且與Nrf2的穩(wěn)定性和活性關(guān)系密切，有可能由此參與Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)過程。本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，證明Nrf2與Sirt1蛋白間存在相互作用的前提下，運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)二者的表達(dá)，探討Sirt1/ARE/Nrf2信號(hào)通路對(duì)于PQ中毒小鼠肺損傷的保護(hù)作用，為PQ中毒肺的抗氧化損傷治療提供理論依據(jù)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一:培養(yǎng)小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，用PQ暴露后，利用免疫共沉淀技術(shù)(co-immun

3、oprecipitation，CO-IP)，分別以Nrf2和Sirt1作為一抗，正反驗(yàn)證在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2蛋白與Sirt1蛋白是否具有相互作用;構(gòu)建攜帶Nrf2和Sirt1基因的過表達(dá)慢病毒載體。實(shí)驗(yàn)二:通過綠色熒光表達(dá)量驗(yàn)證慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，并以PCR和Western-blot技術(shù)分別從基因和蛋白水平檢測(cè)Nrf2及Sirt1的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)三:利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系(bone marrow

4、mesenchymal stem cells，BMSC)較強(qiáng)的遷移能力及向受損肺組織“歸巢”的特性，建立攜帶Nrf2、Sirt1的BMSC系，再用其對(duì)PQ中毒小鼠進(jìn)行干預(yù)。145只ICR小鼠分為以下8組:①空白對(duì)照組②NS組③PQ組④PQ+NS組⑤PQ+LV-MSC-GFP組⑥PQ+LV-MSC-Nrf2組⑦PQ+LV-MSC-Sirt1組⑧PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組。分別于PQ染毒后3d、7d、14d、21d麻醉處死，

5、每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只，空白對(duì)照組直接麻醉處死，取肺組織。運(yùn)用PCR和Western blot技術(shù)分別從基因和蛋白水平觀察Nrf2及Sirt1的動(dòng)態(tài)改變;化學(xué)比色法檢測(cè)肺組織MDA、SOD、CAT、GSH含量或活性;ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1水平;光鏡聯(lián)合透射電鏡觀察小鼠肺組織損傷情況。
　　結(jié)果:
　　1.CO-IP正反實(shí)驗(yàn)表明，PQ暴露的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，Nrf2蛋白與Sirt1蛋

6、白有相互作用。
　　2.通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況，各過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率均在80％以上，LV-Nrf2和LV-Sirt1感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，PCR和Western-blot技術(shù)顯示LV-Nrf2和LV-Sirt1在感染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中基因和蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)。
　　3.空白對(duì)照組與NS組、PQ組與PQ+NS組數(shù)據(jù)高度類似，不再重復(fù)比較;PQ+LV-MSC-GFP組與PQ組無明顯差異

7、。
　　(1)與空白對(duì)照組比較，3d時(shí)，PQ組Nrf2、Sirt1基因及蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）;與PQ組比較，PQ+LV-MSC-GFP組Nrf2、Sirt1基因表達(dá)量基本無改變，而蛋白表達(dá)水平稍高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; PQ+LV-MSC-Nrf2組、 PQ+LV-MSC-Sirt1組、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組Nrf2、Sirt1基因及蛋白表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），其中PQ+LV-MSC-Nrf

8、2/Sirt1組最高。隨著時(shí)間的推移，各組其表達(dá)量逐漸降低，至21d，PQ組較各干預(yù)組相比Sirt1和Nrf2的水平更低。
　　(2)肺組織勻漿中:與空白對(duì)照組比較，PQ組MDA含量明顯升高，SOD、CAT活性均較低，GSH含量下降;與PQ組比較，基因轉(zhuǎn)染干預(yù)后MDA含量明顯下降，SOD、CAT活性，GSH含量明顯升高。
　　(3) ELISA結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組小鼠血清比較，PQ組3d時(shí)TNF-α、IL-1β、IL-10

9、、TGF-β1明顯升高(P＜0.05)，TNF-α、IL-1β升高的幅度整體高于IL-10、TGF-β1，隨著時(shí)間的推移，各炎癥因子含量逐漸下降，21d時(shí)，已與空白對(duì)照組差異不大;與PQ組比較，相同時(shí)間點(diǎn)，PQ+LV-MSC-Nrf2組、PQ+LV-MSC-Sirt1組、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組TNF-α、IL-1β含量較低（P＜0.05），而IL-10、TGF-β1含量明顯升高（P＜0.05），其中PQ+LV-MSC

10、-Nrf2/Sirt1組干預(yù)效果最好。
　　(4) PQ染毒后，PQ小鼠出現(xiàn)倦怠少動(dòng)，反應(yīng)遲緩，毛色于枯，呼吸急促等表現(xiàn);采用Sirt1或Nrf2基因干預(yù)后均可明顯改善以上中毒癥狀，聯(lián)合Sirt1和Nrf2干預(yù)組與正常小鼠表現(xiàn)相似。PQ中毒小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥和出血，ACE-Ⅱ細(xì)胞損傷嚴(yán)重;采用Sirt1或/和Nrf2進(jìn)行干預(yù)后明顯改善肺組織損傷和炎癥反應(yīng)，利于ACE-Ⅱ修復(fù)。
　　結(jié)論:PQ中毒后小鼠肺組織Sirt1