S100A13基因對甲狀腺癌TT細胞生長特性及FGF-1釋放的研究.pdf

1、目的:
　　建立穩(wěn)定過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞系,研究S100A13基因過表達對甲狀腺癌TT細胞生長及細胞周期的影響,探討S100A13基因在甲狀腺癌發(fā)生中的作用;將S100A13 shRNA入門質粒轉染甲狀腺癌TT細胞系,研究S100A13沉默對應激誘導FGF-1釋放的影響。
　　方法:
　　應用Lipofectamine2000將真核表達載體pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13和空載體pc

2、DNA3.1/NT-GFP導入TT細胞系,經G418抗性篩選得到穩(wěn)定的克隆并擴大培養(yǎng)成系,激光共聚焦顯微鏡觀察外源性S100A13蛋白定位。采用Real Time PCR和Western Blot鑒定穩(wěn)定表達S100A13的TT細胞系,應用細胞生長曲線、流式細胞術研究過表達 S100A13基因對 TT細胞生長速率和細胞周期的影響。將S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門質粒轉染TT細胞,應用Real Time PCR法、間

3、接免疫熒光法及 Western Blot方法檢測細胞內 S100A13基因及蛋白表達的抑制效率,進一步應用間接免疫熒光,RT-PCR及ELISA檢測S100A13沉默后無血清處理甲狀腺癌TT細胞內FGF-1釋放變化。
　　結果:
　　成功建立了穩(wěn)定過表達S100A13和空載體的細胞系TT-S100A13-GFP、TT-GFP。TT-S100A13-GFP細胞組較 TT-GFP和TT細胞組生長速度快[(2.30±0.24)×1

4、05vs.(1.40±0.25)×105和(1.50±0.22)×105,(P<0.05)];流式細胞儀結果顯示TT-S100A13-GFP細胞組S期和G2/M期所占比例較TT-GFP和TT細胞組明顯增高。[S期:(6.47±0.14)％vs.(5.86±0.23)%和(5.99±0.28)%,(P<0.05),G2/M:(50.27±0.66)%vs.(39.39±0.23)%和(39.64±0.64)%,(P<0.05)]。S100

5、A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體轉染TT細胞后能夠抑制S100A13基因及蛋白表達。應用間接免疫熒光、Real Time PCR及 Western-blot方法檢測 S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體對S100A13靶基因的抑制效率約為50%, SR-PSOX shRNA干擾對S100A13基因無抑制作用。間接免疫熒光表明,S100A13 shRNA誘導S100A13沉默對正常培養(yǎng)的甲狀腺癌TT細胞

6、系的FGF-1的分布沒有影響,FGF-1彌散分布于整個細胞;無血清處理后胞質中的FGF-1明顯減少,但S100A13沉默的TT細胞胞質中FGF-1較TT細胞多。RT-PCR結果顯示,S100A13沉默對正常培養(yǎng)的甲狀腺癌 TT細胞系的FGF-1的mRNA表達水平無影響,但無血清處理后S100A13沉默的TT細胞中FGF-1的表達較高。ELISA結果顯示,S100A13 shRNA誘導S100A13沉默對正常培養(yǎng)上清中FGF-1的濃度無影

7、響(P>0.05);無血清處理后S100A13沉默的TT細胞培養(yǎng)上清中FGF-1的濃度較低(P<0.05)。
　　結論:
　　成功構建了穩(wěn)定過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞系,穩(wěn)定過表達S100A13基因對TT細胞的生長有促進作用,外源性S100A13基因亞細胞定位于 TT細胞胞質。內源性 S100A13基因定位于 TT細胞胞質。S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體能有效、特異性地抑制S100A