肺癌特異性DKK1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分析預(yù)測及活性篩選.pdf

1、DKK1是經(jīng)典 wnt信號通路的拮抗劑。它可以與 Lrp5/6受體結(jié)合,對 wnt信號通路產(chǎn)生競爭性抑制作用。此外DKK1還能夠與親和受體Kremen及Lrp6受體結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)吞作用,從而減少細(xì)胞膜表面 Lrp6受體的數(shù)量。DKK1能夠在肺癌中特異性、高水平表達(dá)。DKK1主要在胚胎組織中表達(dá),在正常細(xì)胞中不表達(dá)。但是 DKK1在多種非小細(xì)胞細(xì)胞系、組織中均高水平表達(dá)。與其它惡性腫瘤、良性肺疾病和健康對照組相比,肺癌患者血清中 DKK

2、1濃度顯著升高,可作為肺癌診斷的一種血清標(biāo)志物。
　　目前關(guān)于肺癌中 DKK1特異性高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究鮮有報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn) DKK1啟動子在肺癌細(xì)胞中的活性并不是很高,說明可能存在增強(qiáng)子等元件調(diào)控DKK1的表達(dá)。因此DKK1增強(qiáng)子元件的篩選將有助于DKK1的肺癌特異性調(diào)控機(jī)制研究。
　　本研究的關(guān)鍵難點(diǎn)在于對 DKK1基因增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在基因組中的分布進(jìn)行預(yù)測及定位。為此,本文將四段不同長度的 DKK1啟動子片段

3、構(gòu)建到pGL3-basic載體中。我們將構(gòu)建得到的重組載體轉(zhuǎn)染A549、H460、H446、Eca-109、Chang liver和 HEK293細(xì)胞,并通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測不同長度DKK1啟動子片段活性,最終我們確定 DKK1-5片段活性較好,可作為 DKK1基因近端啟動子片段。然后通過 UCSC人類基因組瀏覽器獲取 A549細(xì)胞中DKK1基因位點(diǎn)的DNase I超敏性、組蛋白修飾等表觀遺傳信息。通過對這些信息的分析,預(yù)測得

4、到12條候選增強(qiáng)子元件片段。最后將候選片段分別插入到DKK1-5近端啟動子上游,成功構(gòu)建了12種重組質(zhì)粒。并在細(xì)胞水平上通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)驗(yàn)證相關(guān)候選元件的增強(qiáng)子活性。
　　本文首次獲得六段候選元件: TRE3、TRE4、TRE6、TRE7、TRE8、TRE12在A549細(xì)胞中對DKK1啟動子具有顯著增強(qiáng)作用。TRE3、TR4、TRE12在H460中具有顯著增強(qiáng)作用。且TRE3、TRE4、TRE7、TRE8對DKK1啟