豬糖皮質(zhì)激素受體基因表達(dá)的組織特異性：?jiǎn)?dòng)子活性和LPS處理下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)作為一種核受體，介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素的作用，調(diào)節(jié)機(jī)體一系列生理活動(dòng)。GR廣泛分布于機(jī)體組織細(xì)胞中，但其表達(dá)和功能具有組織特異性。GR基因由9個(gè)外顯子(exon)構(gòu)成，其中exon1是非翻譯性外顯子。GR通過蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能，GR蛋白表達(dá)與其mRNA水平密切相關(guān)，因此轉(zhuǎn)錄調(diào)控是GR組織特異性分布的一個(gè)重要調(diào)節(jié)機(jī)制，exon1mRNA變體的表達(dá)與GR mRNA水平密切相關(guān)，

2、GR選擇性啟動(dòng)子調(diào)控各自exon1mRNA變體的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室之前確定了豬GR啟動(dòng)子區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)其與人和大鼠具有極高的同源性，并鑒定出7種GR exon1 mRNA變體。但目前豬GR基因及其exon1mRNA變體組織特性分布的研究甚少，其選擇性啟動(dòng)子活性分析仍為空白，GR組織特異性抗炎功能以及GR在炎癥狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制也不清楚。本研究確定了總GR mRNA及各exon1mRNA變體的組織特異性分布模式;分析了GR選擇性啟動(dòng)子活性的組

3、織特異性;檢測(cè)了L1-4和L1-10在不同類型細(xì)胞中對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感性;檢測(cè)了在LPS刺激下，豬肝臟、肌肉中GR組織特異性的表達(dá)及其功能;闡述了LPS處理下，GR的組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。
　　1、豬GR基因組織特異性表達(dá)及其啟動(dòng)子活性分析
　　在人上已經(jīng)證明exon1mRNA變體的表達(dá)影響GR mRNA的組織特異性分布和功能。在豬上，GR功能具有組織特異性，但是目前對(duì)豬GR組織特異性分布的研究還很少。因此，本實(shí)驗(yàn)用

4、絕對(duì)定量real-time PCR檢測(cè)了大白斷奶仔豬總GR mRNA及其exon1mRNA變體在海馬、肝臟和肌肉三種組織中的分布。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室剛剛發(fā)表的GR5'UTR序列，用PCR克隆待檢測(cè)的GR exon1mRNA變體，將得到的PCR產(chǎn)物與pSPT18連接后得到重組質(zhì)粒，單酶切質(zhì)粒后得到絕對(duì)定量PCR中所需的標(biāo)品，然后用real-time PCR檢測(cè)總GR及exon1-4、1-12、1-6、1-7和1-9/10變體mRNA的拷貝數(shù)。結(jié)

5、果顯示總GR mRNA拷貝數(shù)及絕大部分exon1mRNA變體的拷貝數(shù)均呈現(xiàn)組織特異性:在肝臟中表達(dá)水平最高，在海馬中最低。
　　為了確定GR選擇性啟動(dòng)子活性的組織特異性，研究GR exon1 mRNA變體組織特異性分布的機(jī)理，首先克隆了短型(S1-4、S1-5、S1-6、S1-7、S1-10、S1-12)和長(zhǎng)型GR啟動(dòng)子（L1-4、、L1-5、L1-6、L1-7、L1-10）片段，并連入pGL3-basic質(zhì)粒中構(gòu)建啟動(dòng)子活性分析

6、質(zhì)粒，然后在HepG2、SY5Y、C2C12三種細(xì)胞中對(duì)這些啟動(dòng)子片段進(jìn)行活性分析，并比較短型和長(zhǎng)型啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明長(zhǎng)型啟動(dòng)子活性比短型啟動(dòng)子更符合在體exon1mRNA變體表達(dá)的情況，并表現(xiàn)出組織特異性。
　　結(jié)果表明，豬GR exon1 mRNA變體的表達(dá)存在組織特異性，并與總GR mRNA的組織特異性表達(dá)一致。GR exon1mRNA變體的組織特異性分布與GR長(zhǎng)型選擇性啟動(dòng)子的組織特異性活性有關(guān)。
　　2、GR啟動(dòng)

7、子對(duì)糖皮質(zhì)激素的細(xì)胞特異性應(yīng)答
　　糖皮質(zhì)激素的作用要通過GR介導(dǎo)，同時(shí)在糖皮質(zhì)激素作用下，GR的mRNA表達(dá)水平也會(huì)受到GR的調(diào)控。在人和大鼠上已經(jīng)證實(shí)，在糖皮質(zhì)激素的刺激下，GR啟動(dòng)子活性發(fā)生變化，并存在組織或細(xì)胞特異性，但是糖皮質(zhì)激素對(duì)豬GR啟動(dòng)子活性的影響的相關(guān)研究仍是空白。
　　為了研究糖皮質(zhì)激素刺激下豬GR基因的組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，選用HepG2（人肝癌細(xì)胞）、SY5Y（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）、C2C12

8、（小鼠成肌細(xì)胞）三種細(xì)胞，檢測(cè)糖皮質(zhì)激素處理對(duì)GR選擇性啟動(dòng)子活性的影響。首先用地塞米松(DEX)刺激HepG2，分別對(duì)S1-4（含有1個(gè)nGRE）和S1-6（不合nGRE）兩種短型選擇性啟動(dòng)子進(jìn)行活性分析。發(fā)現(xiàn)在DEX處理下，只有S1-4啟動(dòng)子活性發(fā)生上調(diào)，而S1-6沒有變化。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DEX處理后，三種細(xì)胞中內(nèi)源性GR蛋白水平均顯著下調(diào)，此時(shí)內(nèi)源性GR對(duì)自身啟動(dòng)子活性在生理狀態(tài)下的抑制作用明顯下降，因而表現(xiàn)出

9、DEX作用下，含有nGRE的片段活性顯著增強(qiáng)。在0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM DEX處理下，用CCK-8試劑盒檢測(cè)三種細(xì)胞的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示細(xì)胞活力沒有變化。在0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、10μM DEX處理下，在三種細(xì)胞中，用雙螢光素酶報(bào)告基因分析兩種含有不同數(shù)目nGRE的長(zhǎng)型GR啟動(dòng)子片段L1-4（1個(gè)）和L1-10（3個(gè)）的啟動(dòng)子活性，結(jié)果顯示，在HepG2中L1-10對(duì)DEX的敏感性

10、高于L1-4，nGRE的數(shù)目會(huì)影響啟動(dòng)子對(duì)糖皮質(zhì)激素應(yīng)答的敏感性，并且這種影響表現(xiàn)出細(xì)胞特異性。
　　結(jié)果表明，在糖皮質(zhì)激素刺激下，在HepG2、SY5Y、C2C12三種細(xì)胞中，GR選擇性啟動(dòng)子上的nGRE使啟動(dòng)子活性上調(diào)。GR選擇性啟動(dòng)子對(duì)糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答敏感性與啟動(dòng)子上nGRE的數(shù)目有關(guān)，并表現(xiàn)出細(xì)胞特異性。
　　3、LPS處理下GR組織特異性的表達(dá)及功能
　　LPS會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，以清除侵入機(jī)體

11、的病原體，然而過度的免疫反應(yīng)會(huì)引起組織損傷。LPS可以引起HPA軸激活，使腎上腺生成并釋放糖皮質(zhì)激素，GR介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抑制炎癥的作用。
　　那么LPS處理下GR的組織特異性表達(dá)是否對(duì)炎性產(chǎn)生組織特異性影響呢？ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS處理下炎性因子TNF-α和IL-6在肝臟中顯著升高(P＜0.05)，而在肌肉中不變。為了探討肝臟、肌肉中的炎性反應(yīng)不同產(chǎn)生的原因，我們檢測(cè)了肝臟、肌肉中的皮質(zhì)醇含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LPS刺激下皮

12、質(zhì)醇水平在兩種組織中都顯著升高(P＜0.05)。接著檢測(cè)了肝臟和肌肉中GR的表達(dá)，用Western blot檢測(cè)GR蛋白表達(dá)，用real-time PCR檢測(cè)GR mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在LPS處理下肝臟中GR蛋白及mRNA水平顯著下調(diào)，而在肌肉中不變。
　　用ChIP檢測(cè)GR與TLR4、TNF-α和IL-6啟動(dòng)子片段的結(jié)合水平發(fā)現(xiàn)，LPS處理下，在肌肉和肝臟中，GR與TLR4啟動(dòng)子上的結(jié)合不變，在肝臟中GR與TNF-α和IL-6啟

13、動(dòng)子的結(jié)合水平降低，而在肌肉中不變。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS處理下肝臟中發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)，而在肌肉中沒有。糖皮質(zhì)激素水平的改變平并不是引起組織特異性炎癥的原因，組織特異性抗炎功能是由炎癥狀態(tài)下GR的組織特異性表達(dá)造成的，肝臟中的GR表達(dá)水平下調(diào)使肝臟中發(fā)生了糖皮質(zhì)激素抵抗，從而使肝臟中GR不能發(fā)揮抗炎作用。肝臟中GR蛋白和mRNA的同向變化提示，GR轉(zhuǎn)錄調(diào)控在GR的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。
　　4、LPS處理下GR組織

14、特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制
　　為了探討LPS處理下GR exon1 mRNA變體表達(dá)的變化方式，用real-timePCR檢測(cè)LPS處理下肝臟、肌肉中GR exon1mRNA變體的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝臟中exon1-4、1-5、1-6 mRNA表達(dá)都顯著下降(P＜0.05)，其他exon1 mRNA變體沒有變化，而肌肉中exon1-4、1-5、1-6三種變體的mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，exon1-10顯著升高。
　　為

15、了確定在LPS處理下轉(zhuǎn)錄因子對(duì)GR組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，用Western blot和ChIP，分別檢測(cè)了能夠與GR啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)錄因子和GR啟動(dòng)子的結(jié)合情況，結(jié)果顯示LPS刺激下，p-CREB蛋白表達(dá)在肌肉中顯著升高(P＜0.05)，在肝臟中不變;p-GR蛋白水平在肝臟中顯著降低(P＜0.05)，在肌肉中不變。p-CREB在肝臟中與GR啟動(dòng)子片段1-4、1-5的結(jié)合顯著降低(P＜0.05)，GR與啟動(dòng)子結(jié)合

16、情況p-CREB相似。這些結(jié)果表明，p-CREB作為p38MAPK信號(hào)通路激活的轉(zhuǎn)錄因子，在肌肉中被特異性激活，結(jié)合在GR上啟動(dòng)子，保證肌肉中GR的正常轉(zhuǎn)錄。
　　為了確定LPS處理下組蛋白乙?；瘜?duì)GR組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，檢測(cè)了肌肉中總的組蛋白H3的乙?；揭约癎R啟動(dòng)子上的組蛋白H3的乙?；?。Western blot結(jié)果顯示，肝臟和肌肉中乙酰化組蛋白H3的表達(dá)在LPS的作用下顯著降低，但ChIP的結(jié)果顯示肝臟中GR啟

17、動(dòng)子1-4、1-5上乙?；斤@著降低(P＜0.05)，而在肌肉中僅1-5的乙?；浇档?P＜0.05)，說明組蛋白H3的乙?；接绊懥薌R的組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　用Western blot對(duì)肝臟、肌肉中的免疫反應(yīng)及致炎信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子p65NF-κB及p38 MAPK的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示磷酸化的p65 NF-κB表達(dá)水平在肝臟中顯著升高(P＜0.01)，在肌肉中不變，磷酸化的P38 MAPK表達(dá)水平在肌肉中顯