阿立哌唑、喹硫平與P-糖蛋白相互作用機理研究.pdf

1、目的:通過研究阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白功能、表達的影響和P-糖蛋白對阿立哌唑、喹硫平轉(zhuǎn)運的影響，探討阿立哌唑、喹硫平與P-糖蛋白相互作用的機理。 方法: 1．阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白的作用研究方法 (1)細胞培養(yǎng)及Caco-2單層細胞模型建立，為阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白功能和表達的作用研究提供P-糖蛋白載體細胞和陰性對照細胞，同時為研究P-糖蛋白對阿立哌唑和喹硫平的作用提供轉(zhuǎn)運模型。 Caco

2、-2細胞和ECV304細胞均采用DMEM高糖培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)，細胞熒光免疫法進行P-糖蛋白表達驗證；建立Caco-2細胞單層模型采用transwell板接種細胞，用細胞電位儀、螢光黃及普奈洛爾轉(zhuǎn)運實驗進行模型驗證。 (2)采用MTT法和活細胞計數(shù)法確定喹硫平和阿立哌唑的體外最大無毒濃度，為阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白功能和表達的作用研究及P-糖蛋白對阿立哌唑和喹硫平的作用研究提供與細胞作用的最大濃度，保證細胞活力。 (

3、3)阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白功能的影響以ECV304細胞作為P-糖蛋白表達的陰性對照細胞，維拉帕米作為P-糖蛋白功能抑制的陽性對照，使用熒光分光光度法和流式細胞術(shù)分析阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白底物-羅丹明123在Caco-2細胞中外排的影響。 (4)從mRNA水平和蛋白水平研究阿立哌唑、喹硫平對P-糖蛋白表達的影響環(huán)孢素A作為MDRl基因mRNA上調(diào)和P-糖蛋白表達上調(diào)的陽性對照，不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照，

4、采用RT-PCR技術(shù)分析阿立哌唑、喹硫平對Caco-2細胞MDR1基因mRNA水平表達的影響。使用流式細胞術(shù)分析阿立哌唑、喹硫平對Caco-2細胞上P-糖蛋白表達的影響。 2．P-糖蛋白對阿立哌唑、喹硫平的作用研究方法 (1)測定阿立哌唑、喹硫平與-．糖蛋白的體外親和力，為后續(xù)研究提供參考。 采用磷鉬藍法測定0.01～100μmol/L不同濃度阿立哌唑或喹硫平與P-糖蛋白共孵育時，ATP酶的活性變化，用米氏方程計

5、算親和力參數(shù)V<,max>、K<,m>、V<,max>/K<,m>，得到阿立哌唑、喹硫平與P-糖蛋白的體外親和力。 (2)P-糖蛋白功能對阿立哌唑、喹硫平轉(zhuǎn)運的影響首先建立uplc-MS/MS同時測定阿立哌唑、喹硫平的方法，采用色譜柱為Acquity UPL<'TM> BEH C<,18>柱(100mm×2.1mm,粒徑1.7μm)，柱溫40℃，流動相：乙腈-30 mmol/L醋酸胺=63：37(WV)，流速：0.3 ml.mi

6、n<'-1>，進樣量4μl，質(zhì)譜檢測采用Waters Micromass QuattroPremier XE二極質(zhì)譜儀，選用ESI<'+>，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(=MRM)。樣品氮氣吹干再用1-氯代丁烷-三乙胺(5：0.5)進行提取。再研究阿立哌唑、喹硫平在transwell上的Caco-2細胞單層模型中的雙向轉(zhuǎn)運，考察時間、藥物濃度及P-糖蛋白抑制劑—維拉帕米對阿立哌唑、喹硫平轉(zhuǎn)運的影響；用uplc-MS/MS測定阿立哌唑、喹硫平

7、A到B側(cè)和B到A側(cè)的轉(zhuǎn)運量，計算其表觀滲透系數(shù)。 結(jié)論: 喹硫平和阿立哌唑均為P-糖蛋白的底物，與P-糖蛋白有較高親和力。P-糖蛋白是引起喹硫平和阿立哌唑在轉(zhuǎn)運過程中出現(xiàn)胞內(nèi)外排現(xiàn)象的重要因素之一。 阿立哌唑?qū)-糖蛋白的功能和表達均有抑制作用，阿立哌唑使用一段時間后，P-糖蛋白對阿立哌唑的外排作用減弱，這就是阿立哌唑在臨床應(yīng)用中尚沒有耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生的原因之一。同時提示：臨床上阿立哌唑和P-糖蛋白的其他底物合用時，

8、會有藥物相互作用發(fā)生，阿立哌唑可能會增加P-糖蛋白的其他底物在細胞內(nèi)藥物濃度，從而增加療效或使毒性作用更強。因此，臨床上將阿立哌唑與P-糖蛋白底物合用時，要注意適當(dāng)?shù)膭┝空{(diào)整。喹硫平雖然對P-糖蛋白的功能有抑制作用，但對P-糖蛋白的表達有誘導(dǎo)作用，喹硫平對P-糖蛋白作用的綜合結(jié)果是：使用喹硫平時，P-糖蛋白對喹硫平的外排作用增強，這就是喹硫平在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的重要原因之一。同時提示：臨床上喹硫平和P-糖蛋白的其他底物合用時，會有