日本血吸蟲期特異性新基因Sj314C10的克隆、表達和功能分析.pdf

1、　　利用RACE技術(shù)釣取日本血吸蟲成蟲期特異表達基因ESTs的全長cDNA，以期尋找到新的編碼日本血吸蟲病的診斷抗原或候選分子疫苗。通過分析一系列日本血吸蟲成蟲期特異表達基因的ESTs，篩選其中一條EST設(shè)計巢式PCR引物，進行第一次RACE。純化目的條帶，連接克隆載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽性克隆測序；將測序結(jié)果連接到源序列的EST上；之后進行“電子克隆”得到一新的EST。再以該EST片段設(shè)計巢式PCR引物，用相同方法進行第二次RACE，

2、直到序列不再延伸為止。對兩次RACE后連接得到的DNA序列進行生物信息學(xué)分析，進行GenBank的注冊。然后，選取其完整開放閱讀框(ORF)設(shè)計合成雙酶切位點的引物，進行PCR體外擴增，純化目標條帶。連接到相同酶切的原核表達載體pET28a(+)上，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21。用IPTG誘導(dǎo)表達，觀察各種條件下對重組菌蛋白表達的影響?；厥盏鞍祝瓿杀磉_產(chǎn)物的純化和生物活性研究，并進行蛋白的功能分析。結(jié)果表明經(jīng)兩次RACE擴增，獲得了

3、一含完整ORF的全長基因片段，測序及序列分析表明該基因為日本血吸蟲一新基因，GenBank注冊號為AY847290，命名為Sj314C10。對此基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域分析表明該蛋白氨基酸序列與桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域有78﹪的同源性。IPTG誘導(dǎo)該基因的原核表達重組菌，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)大約在50ku位置出現(xiàn)一條表達條帶，而且隨著時間的推移表達產(chǎn)物的量逐漸增大。同時，研究顯示：溫度、IPTG濃度和表達時相的改變對蛋白包涵體可