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1、目的:檢測(cè)白血病患者和惡性血液病細(xì)胞株中MST1的表達(dá)水平及探討其臨床意義,篩選出MST1低表達(dá)的惡性血液病細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象;采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞株MST1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài);探討3-Deazaneplanocin A(DZNep)及5-雜氮-2’-脫氧胞苷酸(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-2'-CdR)對(duì)
2、MST1基因表達(dá)的影響,同時(shí)檢測(cè)其對(duì)NB4細(xì)胞株增值、凋亡、分化的影響。
方法:應(yīng)用Real-time PCR和Western-blotting檢測(cè)臨床標(biāo)本和5種惡性血液病細(xì)胞株中MST1的表達(dá)狀態(tài)及分析其臨床意義并篩選出低表達(dá)的NB4細(xì)胞株;采用MSP檢測(cè)NB4細(xì)胞株MST1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài);予DZNep及5-Aza-2'-CdR作用于NB4細(xì)胞后,采用CCK-8法觀(guān)察細(xì)胞的增殖情況; Hoechst33258熒光染
3、色法觀(guān)察細(xì)胞凋亡情況,Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率;real-time PCR檢測(cè)MST1、Bcl-2、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)情況;Western-blotting鑒定MST1、procaspase-3、procaspase-9蛋白的表達(dá)變化。
結(jié)果:(1)MST1在急性白血病初治患者較正常人表達(dá)明顯減低(P<0.05),但隨著疾病治療的好轉(zhuǎn),完全緩解患者與正常人比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)
4、意義(P>0.05),對(duì)于復(fù)發(fā)/難治性的急性白血病患者,該基因的表達(dá)較正常人明顯減低(P<0.05),同時(shí),與初治急性白血病患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);MST1基因在急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞株中低表達(dá)。(2)在NB4細(xì)胞中MST1基因啟動(dòng)子區(qū)存在完全甲基化;(3)CCK-8方法檢測(cè)結(jié)果顯示,DZNep及5-Aza-2'-CdR能抑制NB4細(xì)胞增殖并呈藥物濃度依賴(lài)性;其也能抑制細(xì)胞G1-S轉(zhuǎn)換(P<0.05)且聯(lián)合用藥
5、抑制作用更強(qiáng)(P<0.05);Hoechst33258熒光染色可見(jiàn)DZNep及5-Aza-2'-CdR作用均可使細(xì)胞核致密濃染,細(xì)胞凋亡增加,聯(lián)合作用凋亡率增加更明顯;流式細(xì)胞儀檢測(cè)單藥作用細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05),聯(lián)合用藥凋亡率增加更明顯(P<0.05);DZNep及5-Aza-2'-CdR還可能減少Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)procaspase-3、procaspase-9的活化,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。(4)DZNep可能通過(guò)下調(diào)DN
6、MT3B的表達(dá)水平及相關(guān)組蛋白甲基化的修飾使MST1表達(dá)上調(diào);5-Aza-2'-CdR主要通過(guò)下調(diào)DNMT3A的表達(dá)使MST1的表達(dá)上調(diào);兩藥聯(lián)合使MST1的表達(dá)上調(diào)更為明顯。
結(jié)論:(1)MST1基因具有抑癌基因功能在急性白血病患者中低表達(dá),且隨著治療的進(jìn)程,其表達(dá)水平發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化。(2)在NB4細(xì)胞株中MST1基因的啟動(dòng)子區(qū)存在著CpG島的完全甲基化。(3)DZNep及5-Aza-2'-CdR可使細(xì)胞阻滯于G1/S期而使
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