miR-148a調(diào)控破骨細(xì)胞分化及其在SLE患者骨量異常中的作用機(jī)制.pdf

1、第一部分初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者破骨前體細(xì)胞hsa-miR-148a表達(dá)水平和意義
　　目的:分離純化初發(fā)SLE患者和正常對照組的CD14+外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)，研究SLE患者CD14+PBMCs hsa-miR-148a表達(dá)改變。探討hsa-miR-148a表達(dá)與初發(fā)SLE患者骨量異常的關(guān)系。
　　方法:招募相互匹配的31例中國青年女性，

2、其中16人為未接受過糖皮質(zhì)激素治療的初發(fā)SLE患者，15例為正常對照組。用密度梯度離心法分離兩組人群的外周血單核細(xì)胞，然后用免疫磁珠法分選高純度的CD14+PBMCs，并通過實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitativePCR，qRT-PCR)法檢測hsa-miR-148a在兩組人群CD14+PBMCs中的表達(dá)情況。在上述兩組人群的CD14+PBMCs使用重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human-ma

3、crophage colony stimulating factor,rh-MCSF)和人核因子κB受體活化素配體(human receptor activator ofnuclear factor-κB ligand，hRANKL)誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色、TRAP活性測定及實(shí)時(shí)定量PCR法檢測破骨細(xì)胞分化指標(biāo)TRAP/活化T細(xì)胞

4、核因子c1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1）mRNA水平觀察兩組破骨細(xì)胞的分化成熟情況。將anti-miR-148a轉(zhuǎn)染SLE患者的CD14+PBMCs，轉(zhuǎn)染后加入rh-MCSF和hRANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化培養(yǎng)，行TRAP染色、TRAP活性測定及實(shí)時(shí)定量PCR法檢測TRAP/NFATc1 mRNA水平觀察破骨細(xì)胞的分化成熟情況。
　　結(jié)果:(1)初發(fā)SLE患者的骨密度明

5、顯低于正常對照組，而初發(fā)SLE患者CD14+PBMCs中的hsa-miR-148a表達(dá)水平明顯高于正常對照組。
　　(2)與正常對照組相比，SLE患者組TRAP+多核巨細(xì)胞數(shù)量增加，TRAP活性增強(qiáng)，TRAP/NFATc1mRNA水平升高。
　　(3)將anti-miR-148a轉(zhuǎn)染SLE患者的CD14+PBMCs，可抑制TRAP+多核巨細(xì)胞形成，TRAP活性減弱，TRAP/NFATc1 mRNA水平下降。
　　結(jié)論:

6、初發(fā)SLE患者CD14+PBMCs中的hsa-miR-148a表達(dá)明顯升高，導(dǎo)致其破骨活性增強(qiáng)，骨量降低。
　　第二部分 mmu-miR-148a對去卵巢小鼠骨代謝的影響
　　目的:綜合骨密度檢測、Micro-CT分析、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析、成破骨相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平檢測、血清骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)檢測評價(jià)mmu-miR-148a對小鼠骨代謝的影響。
　　方法:將36只6周齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組:去卵巢(Ov

7、ariectomy, OVX)+antagomiR-148a組，OVX+PBS組，OVX+陰性對照(mut-antagomir)組，假手術(shù)(SHAM)+antagomiR-148a組，SHAM+PBS組，SHAM+陰性對照(mut-antagomir)組。去卵巢小鼠模擬絕經(jīng)后狀態(tài)，用mmu-miR-148a的阻滯劑antagomiR-148a實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)骨組織mmu-miR-148a表達(dá)受抑，觀察mmu-miR-148a表達(dá)受抑對去卵巢小

8、鼠骨代謝的影響:用雙能X線骨密度儀(DXA)檢測股骨頸骨礦密度(bone mineral density, BMD); Micro-CT分析檢測脛骨近端骨小梁體積比及骨小梁厚度;骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析骨形成、骨吸收參數(shù);實(shí)時(shí)定量PCR法檢測成破骨相關(guān)因子(NFATc1，TRAP及ALP)mRNA表達(dá)水平及酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)檢測血清骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物(TRAP及B-

9、ALP)。
　　結(jié)果:(1) antagomiR-148a注射后導(dǎo)致小鼠體內(nèi)mmu-miR-148a表達(dá)明顯受抑。
　　(2) SHAM組中，mmu-miR-148a表達(dá)受抑可導(dǎo)致骨密度增加，骨小梁體積比及骨小梁厚度增加，骨形成及骨吸收參數(shù)均下降，成破骨相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平及血清骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物均明顯下降。
　　(3)與SHAM組相比，OVX組小鼠骨密度下降，骨小梁體積比及骨小梁厚度降低，骨形成及骨吸收參數(shù)均升

10、高，成破骨相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平及血清骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物均明顯上升。OVX小鼠中抑制mmu-miR-148a表達(dá)可糾正上述改變。
　　結(jié)論: mmu-miR-148a表達(dá)缺失抑制骨吸收，導(dǎo)致骨密度增加，骨微結(jié)構(gòu)改善，阻礙骨質(zhì)疏松進(jìn)展。
　　第三部分 mmu-miR-148a對小鼠破骨細(xì)胞分化的功能研究
　　目的:研究mmu-miR-148a在RAW264.7細(xì)胞及小鼠骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中的作用。

11、　　方法:用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)RAW264.7及小鼠骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，qRT-PCR法檢測mmu-miR-148a在此過程中的表達(dá)模式。用pSilencer4.1-CMV puro合成mmu-miR-148a表達(dá)載體pre-miR-148a。將miRNA前體(pre-miR-148a)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞及小鼠骨髓單核細(xì)胞，造成mmu-miR-148a過表達(dá)細(xì)胞模型，隨后加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，行TRAP染色觀察破骨細(xì)胞分

12、化情況，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測破骨細(xì)胞分化指標(biāo)TRAP/ NFATc1 mRNA水平。將2'-O-methyl修飾的反義寡核苷酸anti-miR-148a轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞及小鼠骨髓單核細(xì)胞，構(gòu)建mmu-miR-148a表達(dá)降低細(xì)胞模型，行TRAP染色觀察破骨細(xì)胞分化情況，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測破骨細(xì)胞分化指標(biāo)TRAP/NFATc1 mRNA水平。
　　結(jié)果:(1)應(yīng)用qRT-PCR檢測顯示，誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞及小鼠骨髓單

13、核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，mmu-miR-148a表達(dá)逐漸增多。
　　(2)用pSilencer4.1-CMV puro成功構(gòu)建mmu-miR-148a表達(dá)載體pre-miR-148a，用pre-miR-148a轉(zhuǎn)染RAW264.7及小鼠骨髓單核細(xì)胞能使細(xì)胞中mmu-miR-148a表達(dá)明顯升高。
　　(3) RAW264.7及小鼠骨髓單核細(xì)胞過表達(dá)mmu-miR-148a促進(jìn)TRAP+多核巨細(xì)胞形成，