三苯氧胺治療乳腺癌分子作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究三苯氧胺(TAM)是否對(duì)雌激素受體陰性的乳腺癌細(xì)胞具有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用.觀察不同濃度三苯氧胺作用不同時(shí)間后,對(duì)ER陰性的MA782小鼠乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期正負(fù)凋節(jié)因子細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶4(cdk4)、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子(p21/WAF1/CIP1以下簡稱p21)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)蛋白表達(dá)的影響.探討三苯氧胺誘導(dǎo)MA782細(xì)胞凋亡的分子

2、作用機(jī)制,揭示細(xì)胞周期正負(fù)調(diào)控因子在乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及乳腺癌治療方面所起的作用.對(duì)臨床內(nèi)分泌治療雌激素受體陰性的乳腺癌患者,提供新的啟示和實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):常規(guī)培養(yǎng)MA782細(xì)胞,觀察細(xì)胞一般生物學(xué)特性.實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(只加RPMI1640配養(yǎng)基,不加TAM)和 TAM誘導(dǎo)組(按不同濃度和不同作用時(shí)間點(diǎn)分組).(2)細(xì)胞增殖活性檢測(MTT法):用MTT法檢測對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性.(3)流式細(xì)胞儀檢測(FCM)

3、:收集對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞標(biāo)本,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期時(shí)相分布情況.(4)免疫細(xì)胞化學(xué)染色(ICC):用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法(SABC法)鑒定MA782細(xì)胞雌激素受體及上述相應(yīng)蛋白表達(dá)情況,并用病理圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析.(5)RT-PCR:用RT-PCR方法檢測cyclin D1mRNA,TGF-β1 mRNA表達(dá)變化.結(jié)果:(1)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示:MA782細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的一般生物學(xué)特性,25ml培養(yǎng)瓶接種1.2×1

4、05個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)五天達(dá)到增殖高峰,第六天細(xì)胞生長開始出現(xiàn)接觸性抑制.(2)MTT檢測結(jié)果顯示:2 μmol/L TAM對(duì)細(xì)胞沒有明顯影響,6、10 μmol/L TAM則對(duì)細(xì)胞有不同程度的生長抑制作用,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01),且與TAM濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān).(3)FCM檢測結(jié)果顯示:2 μmol/L TAM作用于MA782細(xì)胞24小時(shí)后未出現(xiàn)凋亡峰,而6、10 μmol/L TAM作用24小時(shí)后則出現(xiàn)凋亡峰,細(xì)胞凋亡率分

5、別為7.04％、19.04％.10 μmol/L TAM作用48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率從19.04％上升到51.27％.G0/G1期比例隨TAM濃度增加、作用時(shí)間延長從19.83％上升到98.69％.S期比例從80.17％下降到0％.說明三苯氧胺對(duì)MA782細(xì)胞有明顯的G0/G1期阻滯作用.(4)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:MA782細(xì)胞雌激素受體陰性.2 μmol/L TAM作用不同時(shí)間后,細(xì)胞無明顯上述蛋白變化,6、10μmol/LTAM作

6、用不同時(shí)間后,細(xì)胞cyclin D1、cdk4、PCNA蛋白表達(dá)均有不同程度的下降,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01),而p21,TGF-β1蛋白表達(dá)則有不同程度的上升,與對(duì)照組相比亦差異顯著(P<0.05或P<0.01).(5)RT-PCR檢測結(jié)果顯示:2 μmol/LTAM組無明顯改變,而6、10 μmol/LTAM作用于細(xì)胞24、48小時(shí)后,細(xì)胞cyclin D1mRNA和TGF-β1mRNA表現(xiàn)出不同程度的變化,

7、與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01).結(jié)論:(1)TAM濃度大于2μmol/L時(shí),對(duì)ER陰性的MA782小鼠乳腺癌細(xì)胞有明顯的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用.(2)MA782細(xì)胞cyclin D1、cdk4、PCNA免疫組化染色均呈強(qiáng)陽性,p21、TGF-β 1亦呈陽性,表明上述指標(biāo)均有不同程度的過表達(dá)現(xiàn)象,說明MA782細(xì)胞存在細(xì)胞周期紊亂.(3)TAM可下調(diào)MA782細(xì)胞cyclin D1、cdk4、PCNA蛋白表達(dá),上調(diào)