RNA干擾下調(diào)CIB1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的:1.構(gòu)建靶向鈣整合素結(jié)合蛋白1(calcium-and integrin-binding protein,CIB1)的慢病毒表達(dá)載體pGV-siCIB1。2.研究RNA干擾下調(diào)CIB1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、遷移的作用,并探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法:1.針對(duì)CIB1基因序列(NM_006384),利用RNA干擾序列的設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)針對(duì)CIB1的RNAi序列,合成單鏈DNAoligio,退火配對(duì)產(chǎn)生雙鏈

2、,通過(guò)其兩端所含的酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的RNAi慢病毒載體上;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定陽(yáng)性重組子后,測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)確認(rèn)正確的克隆即為構(gòu)建成功的CIB1基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體pGV-siCIB1。2.將慢病毒表達(dá)載體感染293T細(xì)胞,進(jìn)行病毒的包裝、純化、濃縮及病毒滴度的測(cè)定。以EGFP為報(bào)告基因,分別以MOI值1,5,10,100感染細(xì)胞,觀察感染后48h、72h、96h的感染效率,確定最佳感染

3、時(shí)間以及MOI值。3.采用MTT法檢測(cè)RNAi后CIB1對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡;劃痕試驗(yàn)分別在0h、12h、24h、36h、48h觀察RNAi后CIB1對(duì)U87細(xì)胞遷移的作用。qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因MRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pGV-siCIB1。成功包裝病毒,純化、濃縮及測(cè)定病毒的滴度。2.pGV-siCIB1感染U87具有較高的感染效率,當(dāng)MOI

4、=5時(shí),感染效率達(dá)90％以上。3.MTT法證實(shí)RNAi后CIB1對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)具有時(shí)間依賴的關(guān)系,隨時(shí)間延長(zhǎng),抑制作用逐漸增強(qiáng),24-96h pGV-siCIB1感染組與NC感染組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);流式細(xì)胞術(shù)顯示,RNAi后CIB1誘導(dǎo)了U87細(xì)胞的凋亡,NC感染組、pGV-siCIB1感染組凋亡率分別為0.22%、18.2%;細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示,NC感染組及pGV-siCIB1感染組在0h、12h、24

5、h、36h、48h的細(xì)胞遷移距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而36h、48h NC感染組與pGV-siCIB1感染組的細(xì)胞遷移距離有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,結(jié)果表明pGV-siCIB1感染組與NC感染組相比Bcl-2mRNA的表達(dá)顯著降低,而B(niǎo)ax、P53、P21、Caspase3mRNA的表達(dá)顯著增高。二組凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.