RNA干擾抑制MTDH基因表達(dá)對髓母細(xì)胞瘤EMT的影響.pdf

1、目的:
　　利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Metadherin（MTDH）基因的表達(dá)水平，來觀察和分析該基因?qū)θ怂枘讣?xì)胞瘤Daoy細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenehymal transition，EMT）的影響，初步探討MTDH基因在髓母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法:
　　首先設(shè)計(jì)、合成MTDH基因的小干擾RNA(small interfer

2、ing RNA，siRNA)序列（MTDH siRNA)和陰性對照siRNA序列，進(jìn)而構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒，在E.coli菌株中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，分別提純質(zhì)粒。將本實(shí)驗(yàn)室購買的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Daoy細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定數(shù)量，將細(xì)胞消化后接種于6孔板，每孔含5×105個細(xì)胞，過夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分為三組:MTDH siRNA組、陰性對照siRNA組和普通Daoy細(xì)胞組。待生長至30%-50％密度，MTDH

3、siRNA組、陰性對照siRNA組細(xì)胞分別取MTDH siRNA質(zhì)粒和陰性對照siRNA質(zhì)粒與Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染；普通Daoy細(xì)胞組僅加轉(zhuǎn)染試劑Lipofctamine2000。隨后觀察細(xì)胞的生長狀況，繪制細(xì)胞生長曲線來評價 MTDH對腫瘤細(xì)胞增殖、生長特性的影響，并用TUNEL染色熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MTDH干擾后對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。分別收集三組細(xì)胞，提取總RNA和

4、蛋白質(zhì)，通過RT-PCR檢測MTDH目的基因水平，以及細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)記基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因水平的變化，包括E-Cadherin（CDH1）、vimentin（VIM）等；通過Western-Blot法檢測MTDH蛋白、CDH1蛋白、VIM蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　成功設(shè)計(jì)合成髓母細(xì)胞瘤株Daoy細(xì)胞MTDH的小干擾RNA(MTDH siRNA)序列，并構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照siR

5、NA細(xì)胞組和普通Daoy細(xì)胞組相比，MTDH siRNA組細(xì)胞MTDH mRNA的表達(dá)和VIM mRNA表達(dá)顯著減少（P<0.05），CDH1 mRNA表達(dá)增高（P<0.05）。Western blot印跡實(shí)驗(yàn)表明，MTDH siRNA組與陰性對照siRNA組和普通Daoy細(xì)胞組比較，細(xì)胞中MTDH蛋白和VIM蛋白印的印跡減弱，CDH1蛋白印跡升高。MTDH siRNA質(zhì)粒組與陰性對照siRNA組和普通Daoy細(xì)胞組相比，細(xì)胞生長增殖受

6、到一定程度的抑制，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)陽性，證明干擾MTDH mRNA的表達(dá)后可抑制髓母細(xì)胞瘤的生長，遷移，有效促進(jìn)其凋亡。陰性對照siRNA組和普通Daoy細(xì)胞組間MTDH、VIM、CDH1蛋白的表達(dá)均無顯著差異（P>0.05），細(xì)胞生長增殖沒有受到影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)陰性，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移運(yùn)動能力未受到影響。
　　結(jié)論:
　　MTDH siRNA質(zhì)粒和陰性對照siRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入人髓母細(xì)胞瘤Daoy細(xì)胞株，并有效的抑制了MTDH