酸敏納米載體聯(lián)合傳輸辛伐他汀和noggin siRNA協(xié)同促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化基因調(diào)控的研究.pdf

1、背景：骨缺損是臨床上常見的并發(fā)癥，也是臨床上較為棘手的問題，多由于創(chuàng)傷、感染及腫瘤切除后等因素所導(dǎo)致。骨不連引發(fā)的骨缺損多為原始創(chuàng)傷嚴(yán)重、急診處理不當(dāng)引起，若伴有骨感染時(shí)治療會(huì)更為困難。臨床上多伴有肌肉萎縮、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)僵硬等并發(fā)癥;其他并發(fā)癥如疼痛、肢體功能障礙等不僅給患者帶來了極大身體和心理上的負(fù)擔(dān)，同時(shí)也給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于創(chuàng)傷后部分骨缺損的治療效果欠佳，過去截肢常成為此類疾病的最終治療方式。大量松質(zhì)骨移植對(duì)該病的治

2、療是一個(gè)重大突破。骨搬運(yùn)與骨牽引主要用于2-10cm骨缺損，但存在骨折對(duì)接部分延遲愈合，治療時(shí)間長(zhǎng)等問題;游離骨皮瓣則用于5-12cm的缺損，常見的臨床并發(fā)癥為移植物不穩(wěn)和術(shù)后易再骨折。骨替代材料為另一個(gè)研究熱點(diǎn)，但仍不能達(dá)到治療創(chuàng)傷后部分骨缺損的目的。雖然傳統(tǒng)方法能在一定程度促進(jìn)骨折的愈合，且獲得一定程度的成功，但治療操作難度較大，治療周期較長(zhǎng)，需反復(fù)多次手術(shù)等并發(fā)癥限制了其廣泛應(yīng)用。
　　組織工程骨在解決移植骨的問題上是一個(gè)重

3、大的突破。但就目前而言，尚無將組織工程骨成功轉(zhuǎn)化為自體骨的核心技術(shù)。所以必須尋找一種新的方法促進(jìn)骨生成。BMP-2因能有效地促進(jìn)骨折端的愈合而被廣泛應(yīng)用于臨床，但存在需要量大，供應(yīng)不足，本身制備困難，價(jià)格高昂等問題，嚴(yán)重限制了其臨床的廣泛應(yīng)用。辛伐他汀為臨床上主要的調(diào)血脂的藥物，研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)BMP-2，進(jìn)而促進(jìn)骨折的愈合。但小分子的游離辛伐他汀應(yīng)用存在水溶性低、易在肝臟代謝、穩(wěn)定性差、臨床應(yīng)用劑量大和局部注射細(xì)胞毒

4、性大等問題，也限制了其應(yīng)用。
　　RNAi技術(shù)自從其機(jī)制被發(fā)現(xiàn)以來，已被廣泛被沉默各種靶基因的的治療，具有廣闊應(yīng)用前景。本課題也運(yùn)用RNAi技術(shù)，通過下調(diào)noggin基因的表達(dá)，去除其抑制BMP-2的作用，從另一個(gè)方面促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨。如何將小分子siRNA輸送到細(xì)胞也是現(xiàn)階段必須解決的問題，過去常運(yùn)用病毒載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明病毒載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率雖高，但存在生物安全性問題。另外，siRNA分子在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)存在體

5、內(nèi)循環(huán)不穩(wěn)定，容易被巨噬細(xì)胞吞噬、被核酸酶降解等問題，且分子量較大、本身帶有負(fù)電荷也使得其難以穿過帶同樣負(fù)電的細(xì)胞膜，不能發(fā)揮沉默目的基因的作用，故必須尋找一種新的有效的方式來促進(jìn)其作用。
　　本課題提出利用多功能納米藥物傳輸技術(shù)，索出一種臨床適用、安全經(jīng)濟(jì)的聯(lián)合重建成骨的治療方案。首先，根據(jù)辛伐他汀先誘導(dǎo)VEGF促進(jìn)血管化再通過誘導(dǎo)BMPs促進(jìn)成骨的順序作用機(jī)理，應(yīng)用辛伐他汀促進(jìn)植入骨的成骨;其次，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)BMPs

6、的拮抗蛋白基因noggin的表達(dá)，辛伐他汀與noggin siRNA（針對(duì)noggin的siRNA）聯(lián)用，從而在BMPs轉(zhuǎn)錄和蛋白相互作用兩個(gè)水平同時(shí)促進(jìn)骨生成。但siRNA和辛伐他汀直接用于治療存在給藥效率低和易降解的問題，也很難被共同傳輸?shù)焦切纬蓞^(qū)。因此，利用多功能納米載體將noggin siRNA和辛伐他汀同時(shí)靶向傳輸?shù)匠晒菂^(qū)，促進(jìn)成骨的發(fā)生，發(fā)揮其1+1＞2的協(xié)同增效作用，同時(shí)也提高辛伐他汀的給藥效率，達(dá)到減少辛伐他汀劑量和避免

7、可能的副作用。
　　因此，本課題設(shè)計(jì)合成了一種新型的三元嵌段聚合物聚乙二醇-支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸（N，N-二異丙基乙二胺-芐胺）[mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA)]的酸性敏感納米載體，可用于聯(lián)合傳輸辛伐他汀和noggin siRNA。從而可同時(shí)發(fā)揮藥物及基因治療的雙重效果。辛伐他汀作用于成骨細(xì)胞后會(huì)促進(jìn)BMP-2的表達(dá)，而noggin作為BMP-2的特異性拮抗劑，會(huì)抑制BMP-2的促進(jìn)成骨的作用。利用noggin

8、 siRNA可下調(diào)BMP-2誘導(dǎo)的noggin升高水平，將藥物治療和RNA干擾療法有機(jī)地結(jié)合起來，利用二者協(xié)同作用以達(dá)到促進(jìn)成骨治療骨不連的目的。本文主要通過體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證酸敏響應(yīng)性雙載體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的作用，探討其在治療骨缺損方面的應(yīng)用潛力。
　　目的：本文的研究目的為設(shè)計(jì)一種酸敏納米載體，對(duì)其結(jié)構(gòu)和形狀進(jìn)行表征，進(jìn)一步研究其負(fù)載辛伐他汀和noggin siRNA的能力，空白納米載體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的毒性作用，負(fù)載

9、辛伐他汀的納米載體對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用;同時(shí)研究其體外細(xì)胞內(nèi)吸收定位情況，進(jìn)入細(xì)胞后的釋放情況;最后在基因、蛋白和堿性磷酸酶染色等方面研究納米載體同時(shí)負(fù)載辛伐他汀和siRNA對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的作用情況。
　　方法：1、化學(xué)方法合成聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA)，1H NMR核磁譜對(duì)聚合物進(jìn)行測(cè)試表征;
　　2、BI-200SM動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)(Brookhaven Instruments)

10、對(duì)不同N/P比的納米載體復(fù)合物進(jìn)行粒徑與Zeta電位測(cè)量，所得的每組樣品數(shù)據(jù)，取5次測(cè)量的平均值;
　　3、通過電鏡和繪制時(shí)間-累積釋放量圖分別驗(yàn)證pH值為5.0和7.4時(shí)，在只負(fù)載辛伐他汀或同時(shí)負(fù)載辛伐他汀和siRNA的納米復(fù)合物中，辛伐他汀從納米載體中釋放的體外實(shí)驗(yàn);
　　4、瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同N/P比納米載體與noggin siRNA的復(fù)合情況，按照納米載體是否負(fù)載辛伐他汀將其分為兩組;
　　5、Cell C

11、ounting Kit-8法（CCK8法）檢測(cè)不同濃度無負(fù)載辛伐他汀納米載體(B-mPBP)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的毒性作用;CCK8法檢測(cè)游離不同濃度辛伐他汀和負(fù)載辛伐他汀納米載體(D-mPBP)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響;
　　6、應(yīng)用激光共聚焦(CLSM)定性和流式細(xì)胞術(shù)定量分析檢測(cè)納米載體的細(xì)胞內(nèi)吸收情況;
　　7、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證D-mPBP中不同濃度辛伐他汀和當(dāng)濃度1uM時(shí)，不同作用時(shí)間對(duì)

12、noggin及BMP-2基因表達(dá)的影響;D-mPBP中辛伐他汀濃度為10uM時(shí)，不同濃度noggin siRNA對(duì)noggin及BMP-2基因表達(dá)的影響;
　　8、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證noggin siRNA濃度為120nM時(shí)，D-mPBP中辛伐他汀濃度為1，10 uM時(shí)，noggin及BMP-2基因表達(dá)情況，同時(shí)用Westernblotting實(shí)驗(yàn)、堿性磷酸酶和茜素紅成骨染色進(jìn)一步驗(yàn)證;
　　結(jié)果：1、成功合

13、成了聚合物mPEG-bPEI-PAsp(DIP-BA)，1H NMR核磁譜圖顯示聚合物被成功合成;
　　2、通過動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)對(duì)不同N/P比的D-mPBP/siRNA納米載體復(fù)合物進(jìn)行粒徑和表面電位測(cè)定。當(dāng)N/P=10時(shí)，納米載體復(fù)合物具有相對(duì)較小粒徑(40nm)和較弱的表面正電荷(+8mV)。因此，當(dāng)納米載體復(fù)合物的N/P為10時(shí)，其具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率;
　　3、透射電鏡表征和辛伐他汀體外釋放實(shí)驗(yàn)表明在pH7.4時(shí)，粒

14、徑較為均勻、分布在40 nm左右，此時(shí)藥物呈緩慢釋放狀態(tài);當(dāng)pH5.0時(shí)，膠束膨大聚集，表現(xiàn)出快速釋放行為;
　　4、瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果:當(dāng)N/P比為10時(shí)，siRNA被完全復(fù)合而無條帶跑出，陽離子納米載體無論是否負(fù)載辛伐他汀都不會(huì)影響其負(fù)載siRNA的能力;
　　5、CCK8法驗(yàn)證空白納米載體細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):以N/P=10與siRNA進(jìn)行復(fù)合時(shí)，當(dāng)空白納米載體的濃度高達(dá)430 ug/mL時(shí)，MC3T3-E1細(xì)胞的存活率仍

15、高達(dá)90.5％，此時(shí)納米載體復(fù)合了siRNA，中和了一部分正電，從而降低了其對(duì)細(xì)胞的毒性作用;
　　6、不同濃度的游離辛伐他汀對(duì)細(xì)胞并無毒性或增殖作用;負(fù)載辛伐他汀的納米載體對(duì)細(xì)胞增值有一定作用，但當(dāng)濃度為10uM時(shí)卻抑制細(xì)胞的增殖;
　　7、激光共聚焦實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果:證實(shí)納米載體復(fù)合物能被MC3T3-E1細(xì)胞高效內(nèi)吞，轉(zhuǎn)染率高達(dá)86.4％，進(jìn)入細(xì)胞溶酶體后藥物緩慢釋放，結(jié)果顯示納米載體復(fù)合物是緩慢進(jìn)入細(xì)胞的，10m

16、in時(shí)部分進(jìn)入細(xì)胞，30min時(shí)進(jìn)入更多，到60min時(shí)已大部分進(jìn)入并開始釋放分離，120min時(shí)基本完全釋放;
　　8、熒光定量PCR結(jié)果:納米載體負(fù)載辛伐他汀的濃度為1uM時(shí)的作用效果最好，且最佳作用時(shí)間為48h;當(dāng)noggin siRNA的濃度越高，對(duì)noggin的抑制作用越好，當(dāng)高達(dá)為120 nM時(shí)，對(duì)noggin的抑制作用最好;
　　結(jié)論：本文主要通過體外實(shí)驗(yàn)來探討酸敏響應(yīng)性雙載體在治療骨缺損方面的應(yīng)用潛力。本課題

17、成功合成了聚乙二醇-支化聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸（N，N二異丙基乙二胺-芐胺）(mPEG-g-bPEI-g-PAsp(DIP-BA))的酸性敏感納米載體，運(yùn)用透射電鏡、粒徑電位儀等測(cè)試了聚合物納米載體的形貌和粒徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功制備了粒徑較小、分布均勻的具有酸敏內(nèi)核的納米載體，其粒徑約為40nm，可以避免其快速地被腎臟排除和被RES攝取。從另一方面也增加了藥物的水溶性、延長(zhǎng)了藥物的血液循環(huán)時(shí)間以及改善治療效果。
　　生物學(xué)實(shí)