CXCR4核定位與腎癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、腎癌作為泌尿系腫瘤中最常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和腫瘤致死率一直位于全球男性惡性腫瘤最高發(fā)病率的前10位。最新的數(shù)據(jù)顯示在美國(guó)每年新增腎癌病例約61560例。腎癌一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其預(yù)后將很差。大約有三分之一的新診斷的腎癌患者在診斷時(shí)就存在轉(zhuǎn)移，并且那些診斷時(shí)為局限性腎癌的患者中也有20％到40％會(huì)最終發(fā)展成轉(zhuǎn)移。因此，研究腎癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制，探尋影響腎癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的關(guān)鍵分子和通路，對(duì)于了解轉(zhuǎn)移性腎癌的生物學(xué)特性，明確腎癌轉(zhuǎn)移的分

2、子機(jī)制，豐富轉(zhuǎn)移性腎癌有效治療手段具有極其重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　目的:
　　1)研究CXCR4核定位與腎癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，分析CXCR4核定位對(duì)腎癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后的影響;
　　2）研究CXCR4配體CXCL12在CXCR4核定位過(guò)程中的作用;
　　3）初步探討HIF-1 alpha和CXCR4結(jié)合并促進(jìn)CXCR4的機(jī)制。探究腎癌患者HIF-1 alpha表達(dá)與CXCR4核定位的相關(guān)性，并對(duì)HIF-1 alp

3、ha與腎癌預(yù)后進(jìn)行分析；
　　4）對(duì)CXCR4核定位后如何誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:
　　1)通過(guò)real-time PCR、提取腎癌細(xì)胞核蛋白、western blot、免疫熒光及免疫組化來(lái)檢測(cè)腎癌細(xì)胞在CXCL12刺激前后及腎癌組織中CXCR4表達(dá)情況。
　　2）通過(guò)PCR技術(shù)構(gòu)建同義突變的EGFP-CXCR4、核定位序列突變及同義突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)及空E

4、GFP的慢病毒，并轉(zhuǎn)染病毒后建立穩(wěn)定表達(dá)的腎癌細(xì)胞株。根據(jù)同義突變位點(diǎn)構(gòu)建CXCR4shRNA慢病毒并轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞株，建立穩(wěn)定沉默CXCR4的腎癌細(xì)胞株，再通過(guò)轉(zhuǎn)染同義突變的EGFP-CXCR4、核定位序列突變及同義突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)及空EGFP的慢病毒，建立穩(wěn)定rescue的腎癌細(xì)胞株，并通過(guò)熒光顯微鏡、real-time PCR、提取腎癌細(xì)胞核蛋白、western blot鑒定。
　　3）通

5、過(guò)增殖實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、單克隆形成實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)研究穩(wěn)定表達(dá)EGFP-CXCR4、核定位序列突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)、空EGFP的腎癌細(xì)胞株的生物學(xué)功能情況。
　　4）收集98例在長(zhǎng)海醫(yī)院泌尿外科住院手術(shù)的腎癌患者的病例信息，病理標(biāo)本，構(gòu)建腎癌的組織芯片。通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織芯片中CXCR4核定位情況，研究其與臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　5）通過(guò)構(gòu)建EGFP-CXCR

6、4和pDsRed2-CXCL12質(zhì)粒并共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察CXCR4和CXCL12在細(xì)胞內(nèi)相互共定位的情況。同時(shí)通過(guò)免疫組化、免疫熒光研究腎癌細(xì)胞、腎癌組織芯片中CXCL12表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。
　　6）通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)、核蛋白提取技術(shù)、western blot、免疫組化、免疫熒光研究HIF-1 alpha和CXCR4在腎癌細(xì)胞內(nèi)相互作用的情況。
　　7）通過(guò)HIF-1 alpha抑制劑、CXCL12及缺

7、氧培養(yǎng)對(duì)腎癌細(xì)胞株進(jìn)行處理，通過(guò)western blot、核蛋白抽提技術(shù)檢測(cè)腎癌細(xì)胞株中CXCR4、HIF-1 alpha的表達(dá)情況及核定位情況。
　　8）通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織芯片中HIF-1 alpha核定位及表達(dá)情況，研究其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系。
　　9）通過(guò)免疫組化、western blot技術(shù)研究腎癌細(xì)胞株及腎癌病灶中Vimentin、E-cadherin、CD44等EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)情況，研究CXCR4

8、核定位對(duì)腎癌細(xì)胞EMT的影響。
　　10)通過(guò)提取腎癌細(xì)胞核蛋白、western blot等技術(shù)研究穩(wěn)定表達(dá)EGFP-CXCR4、核定位序列突變的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)、空EGFP的腎癌細(xì)胞株中Vimentin、E-cadherin、CD44等EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)情況，研究CXCR4核定位對(duì)腎癌細(xì)胞EMT的影響。
　　11)通過(guò)HIF-1 alpha抑制劑、缺氧培養(yǎng)、CXCL12對(duì)腎癌細(xì)胞株進(jìn)行處理

9、，通過(guò)westernblot、核蛋白抽提技術(shù)檢測(cè)HIF-1核定位和CXCR4核定位誘導(dǎo)腎癌侵襲的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1)經(jīng)過(guò)CXCL12刺激后腎癌細(xì)胞株ACHN中核蛋白中CXCR4蛋白逐漸增加，并在刺激24小時(shí)內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)CXCR4在核蛋白中的濃度逐漸增加。經(jīng)過(guò)CXCL12刺激后腎癌細(xì)胞中CXCR4蛋白在核內(nèi)表達(dá)。部分腎癌原發(fā)灶中CXCR4在細(xì)胞核內(nèi)有表達(dá)，部分腎癌原發(fā)灶中CXCR4僅在細(xì)胞漿或及細(xì)胞膜上表達(dá)，而在腎癌

10、轉(zhuǎn)移灶中CXCR4在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。
　　2)對(duì)CXCR4的cDNA序列中709-726的堿基進(jìn)行同義突變，將709-726的堿基序列GCCCTCAAGACCACAGTC變成GCTCTGAAAACAACCGTG，氨基酸序列均為ALKTTV。再在CXCR4同義突變的基礎(chǔ)上將氨基酸序列146-RPRK-149突變?yōu)锳AAA，即將436-447堿基AGGCCAAGGAAG突變成GCCGCTGCCGCT。將突變后的CXCR4裝入慢病毒載體，

11、測(cè)序明確突變符合要求。診斷CXCR4原709-726的堿基序列GCCCTCAAGACCACAGTC進(jìn)行設(shè)計(jì)shRNA干擾，序列如下:CCGGCCCTCAAGACCACAGTCATTTCAAGAGAATGACTGTGGTCTTGAGGGTTTTTTG。并裝入shRNA表達(dá)慢病毒。將慢病毒轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞株ACHN，并篩選成穩(wěn)定細(xì)胞株。real-time PCR結(jié)果顯示在EGFP-CXCR4或NLS-CXCR4過(guò)表達(dá)組中CXCR4mRNA表達(dá)明

12、顯升高。熒光顯微鏡下確認(rèn)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株中的熒光表達(dá)，EGFP-CXCR4蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，而NLS-CXCR4蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。抽提細(xì)胞核蛋白進(jìn)行蛋白電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn):EGFP-CXCR4蛋白在核內(nèi)有表達(dá)，而NLS-CXCR4蛋白在核內(nèi)無(wú)表達(dá)。
　　3)增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:從第三天開(kāi)始，EGFP-CXCR4組和EGFP組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而從第四天開(kāi)始，NLS-CXCR4組和EGFP組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:EGFP-CXCR4組OD值最高，EGFP-CXCR4組和NLS-CXCR4組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EGFP-CXCR4組和空EGFP組及ACHN對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NLS-CXCR4組和空EGFP組未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: EGFP-CXCR4組形成的克隆數(shù)最多，NLS-CXCR4組其次，而空EGFP組和ACHN對(duì)照組最少。EGFP-CXCR4組和EGFP組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NLS-CXCR4組和EG

14、FP組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EGFP-CXCR4組和NLS-CXCR4組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)空EGFP的ACHN細(xì)胞、過(guò)表達(dá)EGFP-CXCR4的ACHN細(xì)胞及過(guò)表達(dá)NLS-CXCR4的ACHN細(xì)胞的凋亡水平分別為:14.8％、5.33％和5.28％。顯示核定位突變的組凋亡有所下降。裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皮下移植腎癌細(xì)胞14天后起，EGFP-CXCR4組移植瘤和EGFP組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而EGFP-CXCR4組

15、移植瘤和NLS-CXCR4組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NLS-CXCR4組和EGFP組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4)組織芯片顯示:CXCR4在腎癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，其中出現(xiàn)CXCR4核定位的占所有腎癌標(biāo)本中的64.7％。在腎癌患者單因素生存分析中發(fā)現(xiàn):CXCR4核定位組預(yù)后明顯差于CXCR4陰性組及CXCR4胞漿表達(dá)組。腎癌癌組織中CXCR4的表達(dá)水平與性別、年齡、癥狀、腫瘤直徑大小、腫瘤位置、T分期、N分期、M分期、AJCC腎

16、癌分期、病理類型、Fuhrman分級(jí)均無(wú)關(guān)。
　　5)通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建pEGFP-CXCR4、pDsRed2-CXCL12質(zhì)粒成功。熒光顯微鏡下觀察通過(guò)lipofectamin3000共轉(zhuǎn)染pEGFP-CXCR4、pDsRed2-CXCL12質(zhì)粒入293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光均表達(dá)，且在部分293細(xì)胞中共表達(dá)，形成黃色熒光。熒光顯微鏡下觀察經(jīng)CXCL12刺激24小時(shí)后的腎癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn):CXCR4在細(xì)胞核內(nèi)及細(xì)胞漿有表

17、達(dá)、CXCL12在細(xì)胞漿表達(dá)，CXCL12未在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。CXCL12高表達(dá)預(yù)示腎癌預(yù)后差。
　　6)免疫組化發(fā)現(xiàn):CXCR4核定位陽(yáng)性的腎癌病灶中HIF-1 alpha核定位陽(yáng)性。免疫熒光顯示:CXCL12刺激24h后HIF-1 alpha在細(xì)胞核內(nèi)有表達(dá)。通過(guò)GFP-Trap試劑盒分別對(duì)高表達(dá)空EGFP、EGFP-CXCR4、NLS-CXCR4的腎癌細(xì)胞進(jìn)行pulldown免疫共沉淀，并進(jìn)一步進(jìn)行western blot，發(fā)

18、現(xiàn)HIF-1 alpha在EGFP-CXCR4組及NLS-CXCR4組有表達(dá)，而在空EGFP組無(wú)表達(dá)。
　　7)western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):HIF-1 alpha抑制劑處理后HIF-1 alpha在腎癌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯減少，CXCR4在腎癌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)也明顯減少。在腎癌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)后HIF-1 alpha表達(dá)明顯升高。在CXCL12刺激后，HIF-1 alpha核定位明顯增加。
　　8)組織芯片顯示:HIF-1 alp

19、ha在腎癌的表達(dá)情況和腎癌患者預(yù)后成負(fù)相關(guān)，且HIF-1 alpha核定位組的腎癌患者預(yù)后最差。HIF-1 alpha表達(dá)和腎癌灶的細(xì)胞增殖水平、腫瘤直徑大小明顯相關(guān)。HIF-1 alpha表達(dá)水平與腎癌患者的年齡、性別、腫瘤的位置、Fuhrman分級(jí)、TNM分期等無(wú)明顯相關(guān)。HIF-1 alpha核定位和CXCR4核定位、CXCL12表達(dá)存在相關(guān)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　9)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對(duì)于CXCR4核定位陰性組，CXC

20、R4核定位陽(yáng)性的腎癌灶中Vimentin、caspase-3水平低表達(dá)，E-cadherin水平高表達(dá)，CD44高表達(dá)，NF-kappa B高表達(dá)，PCNA高表達(dá)，Ki-67、CD105高表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示:在缺氧誘導(dǎo)下，腎癌細(xì)胞中HIF-1 alpha表達(dá)增加，CXCR4核定位增加，E-cadherin表達(dá)增高、Vimentin表達(dá)降低、CD44表達(dá)增加。CXCL12刺激后腎癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA表

21、達(dá)增加，Vimentin基因表達(dá)減少，且能被CXCR4受體拮抗劑AMD3100所抑制。CXCL12及缺氧可以增加腎癌細(xì)胞侵襲能力，AMD3100及HIF-1 alpha抑制劑可以抑制腎癌細(xì)胞的侵襲能力。蛋白電泳結(jié)果顯示:腎癌細(xì)胞CXCR4核定位序列突變后E-cadherin表達(dá)增加，而Vimentin表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　1) CXCL12和腎癌細(xì)胞的CXCR4結(jié)合后促進(jìn)了CXCR4蛋白的核轉(zhuǎn)位。腎癌原發(fā)灶中部分患者出

22、現(xiàn)CXCR4核定位，腎癌轉(zhuǎn)移灶中CXCR4核定位明顯。腎癌灶中CXCR4核定位與患者癥狀、腫瘤TNM分期、增殖水平、病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)，CXCR4核定位預(yù)示腎癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，預(yù)后不良。
　　2）CXCR4核定位序列為146-RPRK-149，將其突變后的CXCR4蛋白無(wú)法在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。CXCR4核定位缺失后增殖、侵襲、單克隆形成、裸鼠皮下成瘤能力能力明顯下降。CXCL12在和CXCR4結(jié)合后可能形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞漿。

23、CXCL12未在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。
　　3）HIF-1alpha在細(xì)胞漿內(nèi)和CXCR4相互作用，可能參與了CXCR4的核定位。HIF-1 alpha核定位出現(xiàn)在部分腎癌原發(fā)灶中，腎癌灶中HIF-1 alpha核定位與患者腫瘤大小、增殖水平、病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等明顯相關(guān)，預(yù)示腎癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，預(yù)后不良。
　　4）HIF-1 alpha作為CXCR4入核過(guò)程中的重要靶點(diǎn)蛋白和CXCR4結(jié)合，是缺氧環(huán)境下促進(jìn)腎癌細(xì)胞CXCR4核定位的