MS-275對人牙髓干細胞增殖和分化的影響.pdf

1、近年來，齲病作為臨床上的常見病之一，越來越引起人們的關注，齲病的形成主要是由于細菌及其毒性產(chǎn)物侵害牙本質(zhì)，造成牙體硬組織脫礦，最終形成缺損。而當細菌和其致病因子毒力較強且持續(xù)作用時，則會通過牙本質(zhì)小管導致牙髓組織的損傷。在受到嚴重刺激后，牙髓中的間充質(zhì)干細胞即牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）會遷移并黏附到受損組織，在多種因素調(diào)控下，向成牙本質(zhì)樣細胞分化并產(chǎn)生牙本質(zhì)基質(zhì)，進行組織修復，這為牙齒的修復再

2、生奠定了堅實的細胞生物學基礎。
　　組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）是一類催化組蛋白去除乙?；^程的酶類，在調(diào)控機體乙?；街邪l(fā)揮重要作用，而機體的乙?；脚c腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，而且在干細胞增殖，分化的調(diào)控中有重要作用。我們前期研究結(jié)果表明，在hDPSCs成骨/成牙分化過程中，HDAC1的基因表達量隨時間增加顯著下調(diào)，提示HDAC1可能參與調(diào)控hDPSCs的分化過程。
　　MS-

3、275（Entinostat,SNDX-275）是HDAC1的特異性抑制劑，屬于苯甲酰胺類，它可以選擇性的抑制第一類HDAC，特別是HDAC1，調(diào)控組蛋白的乙酰化水平，從而影響腫瘤相關基因的表達水平，與其他種類的HDACs抑制劑相比，MS-275具有細胞毒性低和抗腫瘤效率高等優(yōu)點，因此成為臨床上一類重要的抗腫瘤藥物。MS-275能夠通過調(diào)控細胞周期蛋白而抑制腫瘤細胞的增殖，同時在胚胎干細胞的成神經(jīng)分化中發(fā)揮重要作用。
　　組織工程

4、技術在醫(yī)學領域組織器官再生中得到了廣泛應用，而各種材料的合理應用成為組織工程技術中重要的環(huán)節(jié)，目前納米材料在組織修復再生中應用廣泛，而仿生多孔納米纖維明膠支架材料（nano-fibrous gelatin（NF-gelatin）hybrid scaffolds）是一種新型的三維立體結(jié)構的支架材料，在物理結(jié)構和化學組成上都與自然形成的牙本質(zhì)相類似，這種三維結(jié)構能夠促進干細胞的粘附、增殖、遷移和分化能力，在組織工程應用中有很大前景，因此我們

5、選用該材料進行進一步研究。本課題旨在成功分離、培養(yǎng)人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的基礎上，通過體內(nèi)外實驗研究 MS-275對 hDPSCs增殖和分化能力的影響，進一步明確HDAC1在hDPSCs增殖和分化中的作用，為牙齒損傷修復與再生提供理新的思路與實驗依據(jù)。主要研究成果如下：
　　1.hDPSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　我們?nèi)?8-22周歲年輕患者因正畸或阻生拔除的健

6、康恒牙，用組織塊與酶消化聯(lián)合法分離、培養(yǎng)hDPSCs，再通過有限稀釋法挑取單細胞克隆，擴大培養(yǎng)。我們通過流式細胞儀鑒定細胞表面標記物，通過成骨、成脂誘導后茜素紅染色和油紅O染色檢測細胞的多向分化能力，證明我們成功分離和培養(yǎng)出hDPSCs。
　　2.MS-275對體外培養(yǎng)的hDPSCs增殖及分化的研究
　　我們前期研究結(jié)果表明，在hDPSCs成骨/成牙分化過程中，HDAC1的基因表達量隨時間的增加顯著下調(diào)，為了進一步探索HDA

7、C1在hDPSCs中的作用，我們選擇其特異性抑制劑MS-275作為研究對象。我們選取20μM MS-275、2μM MS-275、0.2μM MS-275誘導二維平面的hDPSCs，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)：不同濃度的MS-275均對hDPSCs的增殖有抑制作用，且20μM MS-275對細胞有毒性。而經(jīng)過成骨誘導后，與對照組相比，2μM MS-275、0.2μM MS-275均能促進hDPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和成骨/成牙相關基因和蛋白ALP、

8、DSPP、OCN和BSP的表達，且2μM MS-275促進hDPSCs成骨/成牙向分化的作用更強。
　　3.MS-275對在仿生多孔納米明膠支架材料上培養(yǎng)的hDPSCs增殖及分化的研究
　　我們將hDPSCs與20μM MS-275、2μM MS-275、0.2μM MS-275處理后的納米明膠支架材料相復合，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)：在三維立體環(huán)境下，所測不同濃度的MS-275均對hDPSCs的增殖有抑制作用，且20μM MS-

9、275對細胞有毒性。而經(jīng)過成骨誘導后，2μM MS-275、0.2μM MS-275均能促進hDPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和成骨/成牙相關基因和蛋白ALP、DSPP、OCN、BSP的表達，且2μM MS-275促進hDPSCs成骨/成牙向分化的作用更明顯。將hDPSCs與材料復合物進行裸鼠皮下移植結(jié)果顯示：與對照組比較，HE染色和Masson’s染色表明2μM MS-275能夠顯著促進材料上膠原纖維的生成，Von Kossa染色顯示2μM M