脂聯(lián)素對(duì)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷后AdipoR1、AdipoR2及T-cadherin表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分脂聯(lián)素受體在正常SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的分布和表達(dá)
　　 目的：
　　 研究脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)及T-鈣黏蛋白(T-cadherin，T-cad)，三種脂聯(lián)素受體在大鼠乳鼠心肌細(xì)胞上的分布和表達(dá)。
　　 方法：
　　 1.利用酶消化法、差速貼壁法、化學(xué)試劑(5-brdu)抑制法培養(yǎng)原代的乳鼠心肌細(xì)胞，采用α-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，然

2、后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和其自發(fā)搏動(dòng)。
　　 2.選用原代培養(yǎng)72～96h的單層原代心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用RT-PCR和細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)AdipoR1、AdipoR2和T-cadherin的mRNA和蛋白的表達(dá)及分布。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定培養(yǎng)的原代細(xì)胞為心肌細(xì)胞，且其純度可達(dá)95％以上；
　　 2.在SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞上均檢測(cè)到了AdipoR1、

3、AdipoR2、T-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)，其中以AdipoR1和T-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)量高，與AdipoR2的表達(dá)量相比差異顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.脂聯(lián)素受體1、脂聯(lián)素受體2和T-鈣黏蛋白，三種脂聯(lián)素受體在SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞上均有表達(dá)。
　　 2.心肌細(xì)胞上以脂聯(lián)素受體1和T-鈣黏蛋白的表達(dá)為主，脂聯(lián)素受體2表達(dá)量較少。
　　 第二部分脂聯(lián)素對(duì)心

4、肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后AdipoR1、AdipoR2及T-cadherin表達(dá)的影響
　　 目的：
　　 通過原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞并建立缺氧/復(fù)氧(H/R)模型以模擬在體缺血/再灌注，觀察不同濃度脂聯(lián)素(APN)對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷后脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）及T-鈣黏蛋白(T-cadherin，T-cad)表達(dá)的影響，為心臟缺血/再灌注損傷的防治提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　

5、　 方法：
　　 1.利用酶消化法、差速貼壁法、化學(xué)試劑(5-brdu)抑制法培養(yǎng)原代的乳鼠心肌細(xì)胞，采過α-肌動(dòng)蛋白免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和其自發(fā)搏動(dòng)。
　　 2.隨機(jī)分組：
　　 1）正常對(duì)照組；
　　 2）單純H/R組；
　　 3）H/R+3ug/ml脂聯(lián)素組；
　　 4）H/R+10ug/ml脂聯(lián)素組；
　　

6、5）H/R+20ug/ml脂聯(lián)素組；
　　 6）H/R+30ug/ml脂聯(lián)素組。
　　 3.在倒置相差顯微鏡下觀察原代心肌細(xì)胞形態(tài)變化，化學(xué)比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，流式細(xì)胞術(shù)、脫氧核糖核苷酸缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法來(lái)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡。4．用RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)AdipoR1、AdipoR2、T-cadherin的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)各項(xiàng)鑒

7、定培養(yǎng)原代細(xì)胞為心肌細(xì)胞，且純度可達(dá)95%以上。
　　 2.與正常對(duì)照組相比，H/R組，原代心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，原代心肌細(xì)胞偽足縮短或消失，搏動(dòng)減弱甚至消失，折光性下降。細(xì)胞凋亡率顯著增加，TUNEL陽(yáng)性信號(hào)綠色熒光明顯增多，上清液中LDH的釋放量增加，經(jīng)過不同濃度APN預(yù)處理后再進(jìn)行H/R，可較大程度的逆轉(zhuǎn)各指標(biāo)變化。
　　 3.與正常對(duì)照組相比，單純H/R后，T-cad在mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯下降，經(jīng)過不同濃度

8、APN預(yù)處理后再進(jìn)行H/R，可較大程度地逆轉(zhuǎn)各指標(biāo)變化，并且與單純H/R組相比均有顯著差異(P＜0.01)，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　 4.與正常對(duì)照組相比，單純H/R后，AdipoR1在mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯下降，經(jīng)過不同濃度APN預(yù)處理后進(jìn)行H/R，可逆轉(zhuǎn)各指標(biāo)變化，與單純H/R組相比均有顯著差異（P＜0.01），但各APN處理組不依賴APN濃度變化而變化。
　　 5.與正常對(duì)照組相比，單純H/R后，Adi

9、poR2在mRNA和蛋白水平表達(dá)稍下降，不同濃度APN預(yù)處理后進(jìn)行H/R，AdipoR2在mRNA和蛋白水平表達(dá)無(wú)明顯變化，與H/R組相比無(wú)顯著差異(P＞0.01)，且不依賴APN濃度變換而變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.缺氧/復(fù)氧可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷；
　　 2.脂聯(lián)素對(duì)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。
　　 3.脂聯(lián)素可能通過上調(diào)T-cad的表達(dá)逆轉(zhuǎn)H/R所致的心肌細(xì)胞損傷及凋亡，并且脂聯(lián)素對(duì)