Cbl-b介導FLIPL的降解調(diào)控三氧化二砷誘導腫瘤細胞自噬的機制研究.pdf

1、目的：
　　 在過去的20多年里，三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)被成功的用于多種血液惡性腫瘤疾病的治療，最近的臨床試驗證實，在其他實體腫瘤中，ATO也顯示了很好的臨床應用前景。其多種作用機制被廣泛的探討，例如刺激細胞分化、誘導細胞凋亡等，近年來越來越多的證據(jù)表明，自噬在調(diào)控腫瘤細胞存活的過程中發(fā)揮著重要作用。自噬可能扮演著雙面角色，既能誘導細胞對放化療抵抗，又能導致自噬性死亡，這可能與腫瘤細胞的類型，腫瘤

2、發(fā)生的不同階段，藥物作用的不同信號通路密切相關。目前文獻表明，ATO在誘導凋亡的同時能明顯的誘導腫瘤細胞自噬的發(fā)生，然而，具體的信號機制尚不明確，值得進一步研究。
　　 c-FLIP(cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-convertingenzyme inhibitory protein)主要功能是抑制死亡受體介導的細胞凋亡，通常在多種腫瘤組織中表達

3、，在蛋白水平上主要有2種形式，包括長片段的FLIPL、短片段的FLIPs。目前大多數(shù)文獻報道FLIPL在調(diào)控死亡受體介導的細胞凋亡過程中發(fā)揮主要的生物學功能，該基因通過與caspase-8競爭性結(jié)合從而阻斷凋亡通路的轉(zhuǎn)導。最近研究表明，ATO通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)FLIP表達，促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。然而，F(xiàn)LIP是否參與ATO誘導的腫瘤細胞自噬調(diào)控未見報道。
　　 Cbl(Casitas B-lineage Lymph

4、oma)家族蛋白，作為E3泛素連接酶，在調(diào)控泛素化底物蛋白的降解進而影響細胞功能方面發(fā)揮著重要作用，國內(nèi)外研究證實Cbl蛋白能與多種受體/非受體酪氨酸激酶底物結(jié)合，誘導其泛素化降解，我們既往的研究顯示ATO可上調(diào)Cbl-b表達，然而Cbl-b能否通過泛素化FLIPL參與ATO誘導的細胞自噬尚不清楚。
　　 為深入闡述ATO誘導自噬的作用機制，本研究以慢性粒細胞白血病細胞系K562、急性T淋巴白血病細胞系Jurkat、胃癌細胞系M

5、GC803和乳腺癌細胞系MCF-7為ATO誘導自噬模型，研究FLIPL及泛素連接酶Cbl-b在調(diào)控細胞自噬過程中的作用，進一步以胃癌細胞系MGC803為模型，通過RNA干擾技術，探討ATO誘導腫瘤細胞自噬的信號調(diào)控機制。
　　 材料與方法
　　 1、采用臺盼藍拒染法或MTT法測定細胞活力。
　　 2、采用流式細胞儀通過PI染色進行細胞凋亡判定。
　　 3、采用Westernblot檢測蛋白表達。
　

6、　 4、免疫共沉降檢測蛋白間的共結(jié)合。
　　 5、透射電子顯微鏡檢測自噬體形成。
　　 6、采用Lipofectamine2000試劑進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染。
　　 7、統(tǒng)計學處理：每次實驗重復3次，數(shù)據(jù)以Means±SD.表示，采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果
　　 一、ATO誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡和自噬
　　 (一)ATO抑制K562、Ju

7、rkat、MGC803和MCF-7細胞增殖。ATO作用K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細胞24小時和48小時，明顯抑制上述細胞的增殖。24小時的抑制細胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別是4.59±1.53μM、5.92±1.39μM、49.76±8.34μM和59.33±7.90μM。
　　 (二)ATO誘導K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細胞發(fā)生凋亡和自噬。ATO作用K562和Jurkat細

8、胞(5μM)、MGC803和MCF-7細胞(20μM)12小時和24小時，Western blot顯示凋亡相關蛋白PARP發(fā)生裂解，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ水平升高。ATO作用K562和MGC803細胞12小時，透射電子顯微鏡觀察到在細胞胞漿中大量的自噬體形成，直徑在300-900 nm之間。
　　 (三)ATO誘導細胞發(fā)生保護性自噬。在K562和MGC803細胞中，自噬抑制劑氯喹(CQ)(20μM)明顯增強ATO誘導的細胞增殖抑

9、制和凋亡。
　　 二、FLIPL參與調(diào)控ATO誘導的自噬
　　 (一)ATO誘導K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細胞FLIPL水平下調(diào)。ATO作用K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細胞從1小時到24小時，Western blot檢測結(jié)果顯示FLIPL水平以時間依賴方式下調(diào)。
　　 (二)MGC803細胞瞬時轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA，細胞發(fā)生凋亡和自噬。使用siRNA干擾技術，MGC

10、803細胞轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA48小時后，Western blot檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的MGC803細胞發(fā)生PARP裂解和LC3-Ⅱ水平增加。
　　 (三)瞬時干涉MGC803細胞中FLIPL的表達，ATO誘導的自噬明顯增強。MGC803細胞轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA48小時后，ATO(20μM)處理24小時，Westernblot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA組LC3-Ⅱ水平進一步增加。
　　

11、 (四)透射電鏡顯示下調(diào)MGC803細胞FLIPL蛋白表達，ATO誘導的自噬體增多。MGC803細胞轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA48小時后，ATO(20μM)處理12小時，透射電子顯微鏡證實轉(zhuǎn)染FLIPL-siRNA組胞漿內(nèi)自噬體的數(shù)量較對照組明顯增多。
　　 三、Cbl-b調(diào)控FLIPL的泛素化降解參與ATO誘導的自噬
　　 (一)蛋白酶體通路參與ATO誘導的K562和MGC803細胞FLIPL降解。蛋白酶體抑制劑(PS

12、341)(5nM)預處理K562和MGC803細胞12小時，之后ATO作用6小時，Western blot檢測結(jié)果顯示ATO誘導的FLIPL降解被抑制。
　　 (二)ATO誘導K562和MGC803細胞FLIPL泛素化。ATO作用K562細胞3小時或MGC803細胞1小時，免疫共沉淀顯示ATO上調(diào)FLIPL酪氨酸磷酸化水平，誘導FLIPL泛素化。
　　 (三)ATO誘導K562和MGC803細胞上調(diào)Cbl-b蛋白表達。A

13、TO作用K562細胞或MGC803細胞從1小時到24小時，Western blot檢測結(jié)果顯示ATO誘導K562和MGC803細胞以時間依賴方式上調(diào)Cbl-b。
　　 (四)ATO誘導K562和MGC803細胞FLIPL與Cbl-b發(fā)生共結(jié)合。K562和MGC803細胞經(jīng)蛋白酶體抑制劑PS341(5 nM)預處理12小時，之后ATO作用3小時，免疫共沉淀檢測結(jié)果顯示ATO誘導FLIPL與Cbl-b發(fā)生共結(jié)合。
　　 (五

14、)Cbl-b參與ATO誘導MGC803細胞FLIPL的泛素化。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b
　　 shRNA或空載體的MGC803細胞，經(jīng)蛋白酶體抑制劑PS341(5nM)預處理12小時，之后ATO作用1小時、3小時，免疫共沉淀檢測結(jié)果顯示與對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b shRNA的MGC803細胞，明顯抑制ATO誘導的FLIPL泛素化。
　　 (六)Cbl-b參與ATO誘導MGC803細胞自噬調(diào)控。在MGC803細胞中，敲除C

15、bl-b，F(xiàn)LIPL蛋白水平增加，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ水平減少。ATO作用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b shRNA或空載體的MGC803細胞12小時，Western blot結(jié)果顯示敲除Cbl-b，明顯抑制ATO誘導的自噬水平，透射電子顯微鏡證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cbl-b shRNA的MGC803細胞自噬體明顯減少。
　　 結(jié)論
　　 1、ATO抑制K562、Jurkat、MGC803和MCF-7細胞增殖，并誘導細胞發(fā)生凋亡和保護性自噬