泛素E3連接酶CHIP抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心臟重塑的作用機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 熱休克蛋白70羰基末端反應(yīng)蛋白(CHIP)是一個分子伴侶蛋白和含有U-盒子(U-box)的泛素E3連接酶，可促進(jìn)多種蛋白底物被泛素．蛋白酶體系統(tǒng)降解和清除，在心肌細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡、腫瘤、熱應(yīng)急等方面起著重要的作用。但是，CHIP在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化、凋亡和炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究主要探討了CHIP在AngⅡ誘導(dǎo)心肌重塑中的作用及機(jī)制。
　　 方法：
　　 用10

2、周齡野生型小鼠(WT)和心臟特異性過表達(dá)CHIP的轉(zhuǎn)基因小鼠(CHIP-TG)各16只，隨機(jī)分為4組，每組8只：(1)生理鹽水(NS)+WT組；(2)NS+CHIP-TG組；(3)AngⅡ+WT組；(4)AngⅡ+CHIP-TG組。采用植入式微量緩釋泵給小鼠灌注NS和AngⅡ(1500ng/kg/min)，一周后用B超儀檢測動物的心臟功能；心臟組織切片進(jìn)行H&E、Masson染色，分別觀察不同組別心臟組織中炎性細(xì)胞浸潤和膠原沉積的情況；

3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測不同組別心臟中巨噬細(xì)胞(Mac2-陽性細(xì)胞)數(shù)量、單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)、血管細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、膠原Ⅰ型(CollageⅠ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)水平。應(yīng)用RT-PCR檢測不同處理組MCP-1、ICAM-1、CollageⅠ、TGF-β、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及IL-6的表達(dá)水平。應(yīng)用TUNEL染色方法觀察心肌細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用si

4、RNA-GFP和siRNA-CHIP腺病毒感染原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞24小時，然后用AngⅡ(100nM)處理6-24小時，應(yīng)用RT-PCR及TUNEL染色方法檢測不同處理組炎癥因子(如MCP-1、ICAM-1、IL-1β和IL-6)的表達(dá)水平及心肌細(xì)胞的凋亡情況。另外，原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，用絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的抑制劑刺激0.5小時后再用AngⅡ(100nM)處理6-24小

5、時，分別用RT-PCR和TUNEL染色方法檢測IL-1β、IL-6和心肌細(xì)胞凋亡的情況。最后，用免疫印記(Westernblot)法檢測心臟組織及原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中p38MAPK、JNK和NF-KB的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1)在NS處理時，WT和CHIP-TG組心臟功能、病理改變和炎性細(xì)胞浸潤情況均無明顯差別。
　　 2)AngⅡ處理7天后，與NS+WT組相比，AngⅡ+WT組的心臟功能、纖維化面積、細(xì)

6、胞凋亡情況和炎性細(xì)胞的浸潤程度均明顯增加。
　　 3)與AngⅡ+WT組相比，AngⅡ+CHIP-TG組小鼠心臟組織中纖維化面積(Masson染色)、α-SMA、CollageⅠ和TGF-β表達(dá)水平(α-SMA、CollageⅠ、TGF-β免疫組化染色)明顯減少；心臟組織中巨噬胞浸潤(Mac-2染色)及炎癥因子表達(dá)水平(MCP-1、ICAM-1、IL-1β和IL-6)均明顯減少；心肌細(xì)胞的凋亡情況(TUNEL)減輕。
　　

7、 4)原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后顯示，與siRNA-GFP對照組相比，siRNA-CHIP感染后可明顯上調(diào)炎癥因子(如MCP-1、ICAM-1、IL-1β和IL-6)的表達(dá)及增加心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量。
　　 5)CHIP對AngⅡ引起心肌重塑的保護(hù)作用是通過抑制p38MAPK、JNK及NF-κB信號通路的活性而實現(xiàn)的。
　　 結(jié)論：
　　 CHIP通過抑制p38MAPK、JNK及NF-κB信號通路的