奶牛乳腺上皮細胞高溫應答機制的研究.pdf

1、本研究目的在于揭示奶牛乳腺上皮細胞高溫應答機制及調控機理。實驗首先構建奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系，對細胞進行溫度梯度處理，確定適宜的高溫處理溫度，在此基礎上，進一步研究高溫對乳腺細胞生物學活性的影響及作用機理。 1.奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定 運用差酶消化法和反復貼壁法建立體外奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)方法，采用透射電鏡、細胞流式術、免疫組化、免疫印跡等方法對乳腺上皮細胞特性進行檢測。實驗結果表明，運用本方法建立的奶牛乳腺細胞

2、系上皮特性及遺傳特征完備。 2.高溫對乳腺細胞生物學特征的影響 實驗通過臺盼蘭染色、細胞流式術等方法研究高溫對乳腺細胞活性、細胞周期及死亡率的影響。結果表明：(1)40℃/41℃高溫可使乳腺細胞超微結構發(fā)生變化，表現(xiàn)為染色質濃縮、線粒體腫脹、空泡化，形成凋亡小體。(2)40℃/41℃高溫可以抑制乳腺細胞的增殖，使細胞產(chǎn)生G<,2>/M期阻滯，誘導乳腺細胞死亡，并隨高溫強度的增加而作用增強。(3)40℃/41℃高溫可以誘導

3、乳腺細胞產(chǎn)生熱耐受性。 3.線粒體通路在高溫誘導乳腺細胞死亡中的作用 通過對細胞超微結構、細胞增殖、線粒體及相關分子的檢測，研究40℃高溫對奶牛乳腺上皮細胞的作用機制。結果表明，高溫誘導的細胞的死亡呈經(jīng)典的級聯(lián)反應，即染色體分布邊緣化、線粒體腫脹，線粒體膜電位差(△Ψm)降低，Bax/Bcl-2升高，Capsase-3活性極顯著增加，DNA發(fā)生損傷。說明高溫可通過線粒體途徑誘導細胞的死亡。 4.高溫應激狀態(tài)下乳腺

4、上皮細胞HSP72的表達及JNK激酶在乳腺細胞高溫死亡中的作用 應用RT-PCR、免疫組化、細胞流式術、JNK特異性激活劑/抑制劑等方法，研究與細胞熱耐受性密切相關的HSP72表達規(guī)律和JNK激酶在乳腺上皮細胞高溫應答中的作用。結果表明，(1)40℃高溫誘導了奶牛乳腺細胞HSP72的表達，協(xié)助細胞獲得熱耐受性。(2)JNK激酶參與了40℃高溫誘導的乳腺細胞死亡調控，抑制JNK激酶活性可以極顯著地降低細胞死亡率。 本實驗研