CAR和DAF在CVB3感染HeLa細胞中的上調(diào)變化規(guī)律.pdf

1、目的： 柯薩奇病毒（Coxsachievirus，CV）是一類在自然界普遍存在的病毒，屬于小核糖核酸病毒科（Picornaviridas），腸道病毒屬（Enterovirus）?？滤_奇病毒已知有30個血清型，根據(jù)病毒對乳鼠的致病特點及對細胞敏感性的不同，將病毒分成A組和B組，B組病毒有6個血清型B1－B6，可引起特征性傳染性胸肋痛，合并腦膜腦炎、心肌炎、肝炎、溶血性貧血等。其中柯薩奇病毒B3型（CVB3）侵入機體之后，主要導致病

2、毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）、腦膜炎等。從CVB3的感染動力學可得知，CVB3感染的細胞譜十分廣泛，其感染性及程度的主要因素之一取決于這些細胞表面柯薩奇病毒受體與病毒的相互作用；通過分析柯薩奇病毒易感細胞與非感染細胞的差異，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了柯薩奇病毒－腺病毒受體（CAR）、衰變加速因子（DAF）等受體。CAR幾乎表達在所有體細胞的表面，可能與細胞的粘接和增殖有關(guān)，但確切的生物學功能至今還不清楚，近期發(fā)現(xiàn)CAR可作為

3、柯薩奇病毒和腺病毒的共同病毒受體，才受到研究者的廣泛關(guān)注。DAF也廣泛表達于體內(nèi)的多種細胞，早期發(fā)現(xiàn)DAF可作為一種補體調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)節(jié)補體的功能現(xiàn)已明確，但它作為一種病毒受體的功能卻研究甚少。目前，CVB3具體的致病機制還不清楚，CVB3結(jié)合受體時，動態(tài)構(gòu)象中結(jié)合位點的定位、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞骨架的變化等均值得深入研究。 在本實驗中，用CAR抗體和DAF抗體干預HeLa細胞，檢測在CVB3感染時CAR抗體和DAF抗體對細胞的保

4、護作用，間接反映出CAR和DAF在CVB3入侵HeLa細胞過程中所起作用的大??；并分別在RNA水平和蛋白水平上檢測CAR和DAF隨病毒感染時間和濃度的變化規(guī)律。 方法： 1、不同濃度的CAR抗體和DAF抗體對HeLa細胞的保護作用： 實驗分為5組：①V（virus）組：即病毒組，加入CVB3與HeLa細胞相互作用，作為陽性對照；②D（DAF抗體）組：即DAF抗體作用組，在加入CVB3之前，先用DAF抗體與HeLa

5、細胞相互作用。③C（CAR抗體）組：即CAR抗體作用組，在加入CVB3之前，先用CAR抗體與HeLa細胞相互作用。④C+D（CAR抗體和DAF抗體）組：即CAR抗體和DAF抗體共同作用組，在加入CVB3之前，先用CAR抗體和DAF抗體共同與HeLa細胞相互作用。⑤NOR（normal）組：即正常HeLa細胞對照組，用正常的HeLa細胞做為以上各組的陰性對照。 （1）MTT法檢測各組細胞活性：在490nm波長下檢測各組細胞光密度值

6、（OD值），計算出各組均值、細胞相對生存率（RSR）及各組抗體對病毒的抑制率（IR）。 （2）空斑計數(shù)法檢測抗體對病毒毒力的影響：對各組的病毒空斑用計數(shù)器計數(shù)，并計算出各組的空斑形成單位。 2、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT—PCR）檢測CARmRNA、DAFmRNA在CVB3入侵HeLa細胞過程中的表達變化：用Trizol提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照、掃描

7、。將凝膠電泳圖條帶密度進行計算機分析，計算電泳條帶與β—actin擴增條帶光密度值作為其相對表達強度。 3、流式細胞儀檢測CAR和DAF在病毒入侵HeLa細胞過程中表達的變化：CVB3與HeLa細胞相互作用后，加入CAR和DAF的熒光抗體，用流式細胞儀對二者的表達情況進行檢測。 結(jié)果： 1、MTT法檢測結(jié)果：細胞生存率與抗體濃度呈正相關(guān)，在細胞的生存率方面，D組與V組相比差異無統(tǒng)計學意義，C組與V組相比差異有統(tǒng)計

8、學意義（P<0.05），C+D組與V組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在對病毒的抑制率上，C+D組對病毒的抑制效果最好，且在抑制效果上C組+D組

9、顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。1h之后，DAF的表達恢復正常，CAR仍維持在較高水平。并且CAR和DAF的上調(diào)幅度與CVB3的濃度成正相關(guān)。 結(jié)論： 在CVB3侵入HeLa細胞過程中，作為病毒受體的CAR與DAF相比起到更為主要的作用，且CAR和DAF可能具有一定的協(xié)同作用。CVB3的侵入會上調(diào)DAF和CAR在細胞表面的表達，且上調(diào)程度與CVB3的濃度呈正相關(guān)。CVB3在侵入細胞后，細胞表面DAF的表達迅速下調(diào)，這可能