間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW4810上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及可能機(jī)制的體外研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)體外作用于人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,觀察其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymaltransition,EMT)的相關(guān)蛋白表達(dá)改變情況,研究MSC對(duì)SW480細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白/β-連環(huán)素(Wnt/β-catentin),信號(hào)通路的調(diào)控作用和對(duì)此通路相關(guān)靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7),環(huán)氧化酶-2(COX-2),β-catentin

2、的影響,探討間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及可能機(jī)制,為臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。
　　 方法:選取臍帶血來源間充質(zhì)干細(xì)胞,人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),收集3-8代間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。將SW480細(xì)胞設(shè)立對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別用含20％、40％、80％濃度間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。1、采用MTT方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組SW480細(xì)胞的抑制率,

3、篩選受影響最明顯時(shí)間;2、采用劃痕實(shí)驗(yàn)法觀察48小時(shí)內(nèi)各組劃痕愈合程度;3、流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)分別定量測(cè)定48小時(shí)后對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組人SW480細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白E-鈣黏著蛋白(E-cad)、N-鈣黏著蛋白(N-cad)表達(dá)的變化。結(jié)合劃痕實(shí)驗(yàn)及FCM結(jié)果篩選作用最明顯濃度組;4、應(yīng)用FCM檢測(cè)40％濃度MSC上清液培養(yǎng)人SW480細(xì)胞48小時(shí)后Wnt/β-catentin信號(hào)通路下游靶基因MMP

4、-7,COX-2表達(dá)情況。5、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR,RT-PCR)法驗(yàn)證40％實(shí)驗(yàn)組SW480細(xì)胞48小時(shí)后MMP-7,COX-2的表達(dá)改變,并檢測(cè)上游基因β-catentin表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1 MTT結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24h后測(cè)得的抑制率分別為(47.0±8.3)％、(72.4±4.8)％、(78,3±4.7)％,與對(duì)照組相比均具有

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),且各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。于24h、48h、72h檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組抑制率,20％實(shí)驗(yàn)組抑制率由(47.0±8.3)％升至(56.0±3.8)％,40％實(shí)驗(yàn)組由(72.4±4.8)％升至(91.0±5.1)％,80％實(shí)驗(yàn)組由(78.3±4.7)％升至(93.3±4.9)％,均逐漸增高。各實(shí)驗(yàn)組組間相比48h與24h具有極顯著性差異(P＜0.01),而各實(shí)驗(yàn)組在誘導(dǎo)72h后與48h相比抑制

6、率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組在作用48h時(shí)抑制效果最為顯著。
　　 2劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:光鏡下顯示,MSC作用48h后,與對(duì)照組相比,不同濃度實(shí)驗(yàn)組SW480細(xì)胞遷移均減緩,對(duì)照組劃痕較各實(shí)驗(yàn)組劃痕明顯變細(xì)。劃痕寬度:對(duì)照組＜20％組＜40％組=80％組。說明MSC對(duì)SW480細(xì)胞遷移有一定抑制作用,且40％,80％實(shí)驗(yàn)組劃痕在各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度無明顯改變。
　　 3 FCM測(cè)定E-cad、

7、N-cad表達(dá)結(jié)果顯示:不同濃度MSC上清液與SW480細(xì)胞培養(yǎng)48h可使SW480細(xì)胞E-cad表達(dá)呈上升趨勢(shì)、N-cad表達(dá)呈下降趨勢(shì),符合腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程受到抑制時(shí)的分子表現(xiàn)。E-cad表達(dá)由1升至1.148,N-cad表達(dá)由1降至0.977,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。20％實(shí)驗(yàn)組與其它實(shí)驗(yàn)組組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),但40％濃度組與80％濃度組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示40％濃度組對(duì)S

8、W480細(xì)胞影響最為顯著。
　　 4 FCM法檢測(cè)加入40％MSC上清液實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,48小時(shí)后SW480細(xì)胞中MMP-7蛋白表達(dá)由1降至0.965±0.007,COX-2蛋白表達(dá)由1降至0.89±0.0035,二者均具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明:含40％濃度MSC上清液培養(yǎng)液誘導(dǎo)SW480細(xì)胞48h后,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組SW480細(xì)胞中MMP-7的相對(duì)表達(dá)量由0.842降

9、至0.19,COX-2的相對(duì)表達(dá)量由0.558降至0.165,β-catentin的相對(duì)表達(dá)量由0.660降至0.215,mRNA表達(dá)均呈下降趨勢(shì),且與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSC可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,主要與MSC抑制SW480細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),為治療腫瘤開辟了一條具有潛力的途徑。
　　 2進(jìn)一步研究提示MSC抑制上皮