BCL2L10對水牛卵母細胞體外成熟的影響.pdf

1、BCL2L10是一種抗細胞凋亡的BCL-2家族成員，研究表明，其大量而特異性的表達于成年人和小鼠的卵母細胞及早期胚胎，對卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育起到重要的促進作用。本研究旨在探討水牛BCL2L10在水牛各組織中的表達及其對水牛卵母細胞體外成熟的影響，以期進一步明確水牛卵母細胞的成熟機理，為提高水牛卵母細胞體外成熟率提供一定的理論指導意義。本研究包括三個試驗:
　　1.水牛BCL2L10基因的克隆及其在各組織中的表達。結(jié)果表明，克

2、隆所得的基因為600 bp，編碼區(qū)序列長度為558 bp，共編碼185個氨基酸。序列分析顯示克隆所得基因的核苷酸序列與牛、綿羊、小鼠、野豬、人的同源性較高，氨基酸序列同源性較低，表明BCL2L10蛋白在不同物種間發(fā)生了一定的進化;通過生物信息學技術(shù)對BCL2L10蛋白進行結(jié)構(gòu)及功能預測，發(fā)現(xiàn)水牛BCL2L10蛋白為跨膜性蛋白，通過C端跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在細胞膜或細胞器膜上，屬于BCL-2蛋白家族成員，可能參與細胞凋亡調(diào)控過程。實時熒光定量試

3、驗結(jié)果表明，水牛BCL2L10基因主要表達在卵巢組織中，在睪丸組織中也有少量的表達，而在其他組織中未檢測到表達，而其對立互作對象BAX基因在水牛各個組織中均能檢測到表達。
　　2.水牛BCL2L10及其對立互作對象BAX在卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育中的表達。利用免疫組織化學、免疫熒光染色及實時熒光定量PCR等手段檢測BCL2L10及BAX在水牛卵巢、卵母細胞成熟過程及各階段早期胚胎中的表達模式。結(jié)果表明，水牛BCL2L10蛋白在卵

4、巢中的表達主要集中在卵母細胞上，顆粒細胞與卵丘細胞上無表達。在水牛卵母細胞成熟過程中BCL2L10均有表達，且表達呈上調(diào)趨勢，而BAX基因的表達在此過程中沒有明顯的變化。在水牛早期胚胎發(fā)育過程中，BCL2L10基因的表達呈現(xiàn)一個先上調(diào)再下調(diào)的趨勢，且在8細胞期表達量最高，而BAX基因在8細胞前低表達，8細胞后快速上調(diào)，在囊胚期表達量最高。
　　3.利用siRNA干擾技術(shù)抑制BCL2L10基因的表達對水牛卵母細胞體外成熟的影響。利用

5、陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將siRNA轉(zhuǎn)染進GⅤ期水牛卵母細胞，探討下調(diào)水牛卵母細胞BCL2L10基因的表達后對水牛卵母細胞體外第一級體排出率和孤雌激活卵裂率的影響。結(jié)果表明，利用siRNA干擾技術(shù)可以有效的抑制水牛卵母細胞BCL2L10基因轉(zhuǎn)錄水平的表達，與空白組和陰性對照組相比，下調(diào)BCL2L10基因的表達可以使水牛卵母細胞的體外成熟率及孤雌激活卵裂率顯著下降(48.18％、46.65％ vs33.5％;54.72％、61.32％ vs

6、37.52％,p＜0.01)。同時，對BAX、BCL-2、Caspase-3、Caspase-9四個基因的表達水平進行檢測，以驗證下調(diào)BCL2L10基因表達后對凋亡相關(guān)基因的影響。結(jié)果表明下調(diào)BCL2L10基因的表達后Caspase-9基因的表達水平顯著上調(diào)(p＜0.05)，細胞啟動凋亡程序。
　　綜上所述，(1)水牛BCL2L10基因編碼區(qū)為558 bp，共編碼185個氨基酸，BCL2L10蛋白在不同物種間發(fā)生了一定的進化，且主