奶牛乳腺炎病因?qū)W和金黃色葡萄球菌的分子調(diào)查及Fnbp蛋白免疫.pdf

1、乳腺炎是威脅奶牛業(yè)最為頻繁和損失最為嚴(yán)重的疾病之一，世界每年因乳腺炎的損失超過(guò)350億美元，乳腺炎主要包括臨床型和隱性乳腺炎，臨床型乳腺炎可引起棄奶、奶產(chǎn)量暫時(shí)性減少和奶牛的過(guò)早淘汰；隱性乳腺炎可引起乳腺慢性感染從而造成奶產(chǎn)量長(zhǎng)期下降。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)乳腺炎進(jìn)行了大量研究，但仍存在眾多不足：首先對(duì)引起乳腺炎的病原菌缺乏系統(tǒng)研究；針對(duì)近些年來(lái)引起乳腺炎的主要病原菌缺少快速簡(jiǎn)捷的檢測(cè)方法；尤其對(duì)目前乳腺炎的主要病原菌金黃色葡萄球菌缺少分子流行病

2、學(xué)資料；目前國(guó)內(nèi)外還缺少預(yù)防金黃色葡萄球菌效果較好的疫苗；目前我國(guó)對(duì)隱性乳腺炎還缺乏重視；我國(guó)眾多奶牛散養(yǎng)戶在頑固性乳腺炎面前束手無(wú)策等等，為探討、解決以上問(wèn)題，進(jìn)行了本項(xiàng)研究，主要結(jié)果如下： 1.對(duì)不同類型類型乳腺炎的細(xì)菌學(xué)系統(tǒng)分析對(duì)山東7個(gè)地區(qū)14個(gè)奶牛場(chǎng)做了臨床型和隱性乳腺炎調(diào)查，并且采取了臨床乳腺炎病牛234個(gè)乳樣，隱性乳腺炎241個(gè)乳樣分別做了細(xì)菌學(xué)檢查，結(jié)果表明：泌乳期臨床型乳腺炎病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌，金黃色葡

3、萄球菌、鏈球菌、酵母菌和棒狀桿菌為主；干奶期臨床型腺炎病原菌以大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和酵母菌為主；隱性乳腺炎病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌、酵母菌、假單胞菌和棒狀桿菌為主；厭氧菌在隱性乳腺炎、泌乳期臨床型乳腺炎和干奶期臨床型乳腺炎乳樣的檢出率分別為5.82％，4.17％，10.16％；引起隱性乳腺炎和干奶期乳腺炎細(xì)菌的共感染率較高，與引起泌乳期乳腺炎病原菌的共感染率差異極顯著(P＜0.0

4、1)，引起隱性乳腺炎與引起干奶期乳腺炎病原菌的共感染率差異不顯著(P＞0.05)。54個(gè)頑固性乳腺炎中酵母菌(25.92％)、大腸桿菌(12.96％)、凝固酶陰性葡萄球菌(14.81％)、鏈球菌(12.96％)和金黃色葡萄球菌(9.26％)占有較大的比例，但有12.96％的乳區(qū)分離不到細(xì)菌。 2.檢測(cè)乳腺炎主要致病菌：金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和酵母菌的多重PCR方法的建立參照Genebank發(fā)表的序列，在金黃色葡萄

5、球菌，無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌16SrRNA與23SrRNA之間的區(qū)域設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，參照念珠菌和隱球菌的18SrRNA的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了檢測(cè)金黃色葡萄球菌，無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌和酵母真菌4種乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法，結(jié)果表明：本試驗(yàn)建立的多重PCR方法具有較好的特異性。參照Skladny的方法制備模擬了細(xì)菌感染臨床標(biāo)本，多重PCR方法檢測(cè)乳樣中的金黃色葡萄球菌的細(xì)菌最小濃度分別為104cfu/ml，檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌，停乳

6、鏈球菌和酵母真菌的細(xì)菌最小濃度分別為102cfu/ml，103cfu/ml和103cfu/ml。通過(guò)對(duì)臨床型乳腺炎46個(gè)，隱性乳腺炎167個(gè)，共計(jì)213個(gè)乳樣分別用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法和多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，與細(xì)菌培養(yǎng)法比較，多重PCR對(duì)金黃色葡萄球菌和酵母真菌的檢測(cè)具有更高的檢出率(P＜0.01)，但該方法對(duì)無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌的檢出率與培養(yǎng)法差異不顯著(P＞0.05)。 3.奶牛臨床型和隱性乳腺炎主要致病菌金黃色葡萄球菌的分

7、子流行病學(xué)調(diào)查用PCR方法對(duì)臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌124株，隱性乳腺炎金黃色葡萄球菌213株，山羊臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌12株進(jìn)行超抗原毒素sea,seb,sec,sed.See和tst基因的分子調(diào)查，結(jié)果表明：奶牛臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌腸毒素基因和tst基因的陽(yáng)性率為27.42％，隱性乳腺炎腸毒素基因的陽(yáng)性率為1.41％，山羊臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌腸毒素基因的陽(yáng)性率為33.3％。奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產(chǎn)生毒素的類型以

8、SEA,TSST-1和SEC為主，山羊乳腺炎金黃色葡萄球菌產(chǎn)生腸毒素的類型以SEC為主。對(duì)于腸毒素基因和tst基因PCR陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌同時(shí)用ELISA和RPLA兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，3種檢測(cè)方法基本一致，但并不完全吻合，本實(shí)驗(yàn)中1株sea基因陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和4株tst基因陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌用ELISA和RPLA方法檢測(cè)為SEA和TSST-1陰性。 通過(guò)對(duì)引起奶牛臨床型和隱性乳腺炎的337株金黃色葡萄球菌進(jìn)行Fnbp蛋白

9、基因和Cnap基因分子調(diào)查，F(xiàn)nbp蛋白基因攜帶率(51.04％)比Cnap蛋白基因(30.86％)高(P＜0.01)，且臨床型乳腺炎金黃色葡萄球菌Fnbp基因和Cnap基因攜帶率較隱性乳腺炎高(P＜0.01)。 4.奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌Fnbp蛋白基因的克隆、表達(dá)及其免疫原性研究選取分離菌株10A擴(kuò)增出的Fnbp基因，通過(guò)引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，定向插入到融合表達(dá)載體PET-32a中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET-Fnb

10、p,并轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)株中，IPTG誘導(dǎo)4h后，SDS-PAGE電泳表明，重組蛋白得到高效表達(dá)，重組蛋白主要以分泌形式存在，分子量35KDa左右，Ni柱純化后的蛋白經(jīng)Westernblotting檢測(cè)，具有良好的抗原性和特異性。 對(duì)重組菌PET-Fnbp進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，破碎菌體，Ni柱純化蛋白，SDS-PAGE表明獲得高純度的Fnbp蛋白，BCA法蛋白定量為2.8mg/ml，將蛋白凍干制成成品用于動(dòng)物免疫，選取3頭

11、泌乳期奶牛(0288，0368，0314)進(jìn)行5mg/頭/次的劑量免疫，11天后二次免疫，2頭奶牛(0455，0513)作為對(duì)照組，結(jié)果表明，第一次免疫注射后，只有0288號(hào)牛出現(xiàn)體溫升高和奶產(chǎn)量下降外，其它牛正常，3頭實(shí)驗(yàn)牛在30-40d，ELISA檢測(cè)血清抗體滴度達(dá)到高峰，最高抗體滴度達(dá)到2-6，表明該蛋白表現(xiàn)出很好的抗原性。 5.隱性乳腺炎NAGase與不同病原菌、SCC、LDH、ALP、ACP之間的關(guān)系探討對(duì)330個(gè)乳樣

12、分別用CMT，體細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)菌的分離培養(yǎng)法進(jìn)行隱性乳腺炎的檢測(cè)，結(jié)果表明3種方法檢測(cè)的結(jié)果差異不顯著(P＞0.05)。對(duì)分離出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的部分乳樣進(jìn)行了SCC與LDH，NAGase，ALP和ACP幾種酶的測(cè)定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明：LDH與SCC的有顯著的相關(guān)性(r=0.7936)，并且LDH與NAGase、ALP和ACP都有明顯的相關(guān)性；NAGase與ACP、LDH有明顯的相關(guān)性，但與ALP沒(méi)有相關(guān)性；ALP只與ACP和LDH有顯著的相

13、關(guān)性外，與SCC，NAGase沒(méi)有相關(guān)性；ACP與SCC，LDH，NAGase，ALP都有極顯著的相關(guān)性。 6.不同類型乳腺炎奶牛乳腺的病理組織學(xué)觀察及肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)分析對(duì)于金黃色葡萄球菌引起的1例臨床型乳腺炎和2例隱性乳腺炎的乳腺組織進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察和肥大細(xì)胞的計(jì)數(shù)比較，結(jié)果表明：金黃色葡萄球菌引起的化膿性乳腺炎乳腺實(shí)質(zhì)遭到嚴(yán)重破壞，在乳腺腺泡內(nèi)可見(jiàn)到膿腫，腺泡變小，伴隨大量的結(jié)締組織增生，乳腺腺泡周圍和表面有炎性細(xì)胞存在；

14、金黃色葡萄球菌引起的隱性乳腺炎以乳腺組織出現(xiàn)不同程度的滲出性變化為特點(diǎn)，乳導(dǎo)管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞和上皮細(xì)胞；乳腺炎奶牛乳腺組織腺泡中有一定程度的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。主要分布在相鄰腺泡周圍、乳導(dǎo)管上皮周圍，呈圓形或橢圓形，大小不一，胞核小而圓，多位于中央；乳腺炎乳腺組織內(nèi)的肥大細(xì)胞數(shù)目較健康乳腺多，差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)。 7.奶牛臨床型乳腺炎的治療對(duì)臨床型乳腺炎274例的治療實(shí)驗(yàn)表明：復(fù)方丁胺卡那與5％頭孢喹諾