鼻咽癌腫瘤干細胞的分離、鑒定以及生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是東南亞地區(qū)包括我國南部省份常見的惡性腫瘤之一。本研究首先以鼻咽癌CNE2細胞系為研究對象，利用流式細胞儀技術(shù)檢測多種常見腫瘤干細胞標(biāo)記物在其中的表達，初步確定鼻咽癌干細胞的候選特異性表面標(biāo)記。經(jīng)免疫磁珠分選后，進一步選擇3種調(diào)控干細胞多能性及自我更新的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Nanog和Sox2作為檢測指標(biāo)，應(yīng)用細胞免疫熒光顯色技術(shù)，檢測目標(biāo)細胞

2、中3種抗體共表達的情況。探討鼻咽癌腫瘤干細胞存在的可能。其次，在獲得了表達特異性抗原細胞的基礎(chǔ)上，通過一系列試驗，從細胞周期、細胞分化、細胞增殖活性以及體外體內(nèi)成瘤能力方面，鑒定該亞群細胞是否具備強大的自我更新和分化潛力，是否擁有高成瘤性。初步闡明鼻咽癌干細胞相關(guān)亞群的生物學(xué)行為特征，為進一步探索其分子調(diào)控機制奠定堅實的理論基礎(chǔ)。最后，為了更接近于人體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性，我們立足于鼻咽癌原代細胞的培養(yǎng)，通過一系列體內(nèi)、體外試驗探討相同的

3、特異性標(biāo)記物在原代細胞中的表達情況。鑒定其分選后的亞群細胞是否同樣具備腫瘤干細胞的特征。明確鼻咽癌原代細胞模型和已建系的細胞株模型在研究腫瘤干細胞中的異同。為今后進一步創(chuàng)造更接近于人體內(nèi)腫瘤生長微環(huán)境的試驗?zāi)Ｐ吞峁├碚撘罁?jù)。
　　 一、人鼻咽癌細胞株CNE2腫瘤干細胞標(biāo)志的探討
　　 目的：初步確定鼻咽癌干細胞的候選特異性細胞表面標(biāo)記物。
　　 方法：以人鼻咽癌CNE2細胞系為研究對象，利用流式細胞儀技術(shù)檢測候選

4、干細胞標(biāo)志CD34、CD44、CD133在細胞膜中的表達。初步選擇CD133作為鼻咽癌干細胞的候選特異性標(biāo)記進行分選。經(jīng)免疫磁珠法分選后，應(yīng)用細胞免疫熒光顯色技術(shù)，檢測CD133+及CD133-亞群細胞中Oct3/4、Sox2和Nanog3種抗體共表達情況。
　　 結(jié)果：1、鼻咽癌細胞株CNE2細胞中膜抗原CD133呈低度穩(wěn)定表達，表達率為3.36％±0.35％；CD44則大量表達，表達率為82.79％±0.99％；CD34表達

5、較多，表達率為11.76％±1.22％。
　　 2、免疫熒光細胞染色顯示CD133+細胞可同時表達2個調(diào)控干細胞多能性的標(biāo)記物Nanog和Sox2。不表達Oct3/4。
　　 3、免疫磁珠分選效率穩(wěn)定可靠，分選效率平均為89.15％±7.80％。
　　 結(jié)論：1、CD133可以作為鼻咽癌腫瘤干細胞的候選特異性表面標(biāo)記物。
　　 2、免疫磁珠分選技術(shù)是分離提純鼻咽癌細胞株中CD133+細胞亞群的有效方法。<

6、br>　　 二、鼻咽癌細胞系CNE2中CD133+細胞的生物學(xué)特性初探
　　 目的：探討鼻咽癌細胞系CNE2細胞中CD133+及CD133-亞群細胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征和體內(nèi)成瘤能力
　　 方法：以人鼻咽癌CNE2細胞系為研究對象，首先用免疫磁珠分選法得到CD133+細胞及CD133-細胞，隨后通過MTT比色法測定兩亞群細胞的增殖能力，繪制生長曲線；平板克隆形成試驗比較兩亞群細胞的體外克隆形成能力；應(yīng)用流式細胞儀測定細

7、胞周期的分布特點并計算細胞增殖指數(shù)；應(yīng)用流式細胞儀動態(tài)監(jiān)測分選純化后的CD133+細胞在體外培養(yǎng)中CD133抗原表達的變化情況；通過無血清懸浮培養(yǎng)檢測兩亞群細胞的克隆球形成能力；通過裸鼠成瘤試驗，檢驗兩亞群不同數(shù)量的細胞在體內(nèi)的成瘤能力；HE染色檢驗種植瘤的病理組織類型；原代培養(yǎng)種植瘤的腫瘤細胞，并使用流式細胞儀檢測移植瘤細胞中CD133表面抗原的表達。
　　 結(jié)果：1、兩亞群細胞的生長曲線、體外克隆試驗表明， CD133+細胞

8、的自我更新和增殖成瘤能力明顯大于CD133-細胞(P＜0.05)
　　 2、在1個月的觀察期內(nèi)，1×105數(shù)量的CD133+細胞可以在裸鼠背部成瘤，而CD133-細胞不能成瘤。
　　 3、兩亞群細胞的細胞周期分布特點以及細胞增殖指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4、分選出的CD133+細胞在含5％胎牛血清的RPM11640培養(yǎng)基生長，大部分細胞在增值過程中轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌硇偷募毎?，培養(yǎng)至21天后，僅0.37％±0.10％的細

9、胞表達CD133。
　　 5、在無血清培基中，CD133+腫瘤細胞可以懸浮生長，形成類似腫瘤克隆的細胞球，而CD133-細胞則大部分凋亡，僅少數(shù)貼壁緩慢生長。
　　 6、種植瘤組織經(jīng)HE染色檢查證實為低分化非角化型癌。原代培養(yǎng)細胞形態(tài)與CNE2細胞相似。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，CD133陽性細胞約占總數(shù)的2.17％±0.46％。
　　 結(jié)論：1、鼻咽癌細胞株CNE2中，CD133+表型細胞與CD133-表型細胞相

10、比，在體外具有更強的自我更新和克隆成瘤能力；膜抗原CD133呈低度穩(wěn)定表達。
　　 2、鼻咽癌細胞株CNE2中，CD133+表型細胞與CD133-表型細胞相比，在裸鼠體內(nèi)具有更強的成瘤能力。
　　 3、鼻咽癌細胞株CNE2中，CD133+表型細胞具有分化為其他表型細胞的能力。
　　 4、鼻咽癌CNE2細胞株中，CD133+細胞亞群的細胞周期分布特點及細胞增殖指數(shù)與CD133-細胞亞群相比，無統(tǒng)計學(xué)上的差異。

11、>　　 三、人鼻咽癌原代細胞培養(yǎng)及腫瘤干細胞的分選、鑒定
　　 目的：探討鼻咽癌原代細胞中CD133+及CD133-亞群細胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征和體內(nèi)成瘤能力。比較原代細胞與細胞株試驗?zāi)Ｐ偷漠愅c。
　　 方法：應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法得到鼻咽癌原代細胞后，先用免疫磁珠分選法得到CD133+細胞及CD133-細胞，隨后通過用MTT比色法測定兩亞群細胞的增殖能力，繪制生長曲線；平板克隆形成試驗比較兩亞群細胞的體外克隆形成能力；通

12、過體內(nèi)成瘤試驗，檢驗兩亞群不同數(shù)量的細胞在體內(nèi)的成瘤能力。
　　 結(jié)果：1、人鼻咽癌原代細胞可以在Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基中增殖生長，經(jīng)角蛋白(CK)熒光染色表明所培養(yǎng)細胞均為上皮來源。
　　 2、人鼻咽癌原代細胞培養(yǎng)成活率在40％-60％,各株腫瘤細胞增殖傳代能力不同。存活期在2代到6代之間。而且生長最旺盛者，表達CD133表面抗原越多。其中一株表達CD133表面抗原穩(wěn)定在2.8±0.17％左右。

13、　　 3、兩亞群細胞的生長曲線、體外克隆試驗表明，鼻咽癌原代細胞中CD133+細胞的體外增殖成瘤能力大于CD133-細胞(P＜0.05)。
　　 4、原代培養(yǎng)的鼻咽癌細胞分別以1×104及1×105的數(shù)量注入NOD/SCID小鼠(非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)的皮下，在21-30天的觀察期內(nèi)，CD133+及CD133-亞群的細胞均未見瘤塊形成。
　　 結(jié)論：1、采用組織塊培養(yǎng)法，應(yīng)用Keratinocyte-SFM

14、培養(yǎng)基，可培養(yǎng)出相對純化的人鼻咽癌原代細胞。各株細胞增殖傳代能力不同，生長最旺盛者，表達CD133表面抗原最多。
　　 2、鼻咽癌原代細胞中CD133+表型細胞與CD133-表型細胞相比，在體外具有更強的自我增殖和克隆成瘤能力。(P＜0.05)
　　 3、鼻咽癌原代細胞與CNE2細胞株相比，在腫瘤干細胞的構(gòu)成比例上有所減少；在相同的條件下，細胞的自我更新能力、克隆形成能力以及體內(nèi)致瘤能力均有下降。經(jīng)免疫磁珠分選后，鼻咽癌