S100A13基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及生物學(xué)性狀的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建以綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)為報(bào)告基因的重組表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染觀察其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位;以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)S100A13基因的細(xì)胞系,對(duì)比研究轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化及對(duì)抗癌藥物敏感性的差異。
　　方法:從甲狀腺癌組織中提取總RNA,采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增

2、S100A13基因的編碼區(qū)序列,回收PCR產(chǎn)物連接入克隆載體(pGEM-T載體)。擴(kuò)增,質(zhì)粒提取,酶切并測(cè)序鑒定。設(shè)計(jì)帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的上游引物,以第一輪克隆質(zhì)粒為模板, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆入PcDNA3.1/NT-GFP-topo vector,并進(jìn)行測(cè)序鑒定。提取測(cè)序鑒定后的真核表達(dá)載體采用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察該基因亞細(xì)胞定位,RT-PCR驗(yàn)證重組S100A13 mRNA的表達(dá);以轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞實(shí)

3、驗(yàn)參數(shù)為基礎(chǔ),脂質(zhì)體介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)重組S100A13基因細(xì)胞系,觀察該基因在HepG2細(xì)胞的定位,RT-PCR和Western-blot驗(yàn)證重組S100A13 mRNA和蛋白的表達(dá)。半定量RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞 FGF1表達(dá)量的變化;MTT法觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;加入化療藥物5-Fu處理后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡率的差異。
　　結(jié)果:酶切和測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒含有S100

4、A13編碼區(qū)序列且插入方向正確, RT-PCR證實(shí)了S100A13基因在COS-7細(xì)胞中的表達(dá),重組S100A13基因在COS-7細(xì)胞中亞細(xì)胞定位于全胞漿。
　　RT-PCR和Western-blot表明重組S100A13基因在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),熒光顯微鏡下觀察綠色熒光均勻分布于整個(gè)細(xì)胞。半定量RT-PCR表明轉(zhuǎn)染PcDNA3.1/NT-GFP-S100A13組 FGF1表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組及空載體組。但各組細(xì)胞的生長(zhǎng)

5、曲線以及對(duì)化療藥物(5-Fu)的敏感性無顯著差異。
　　結(jié)論:成功克隆了S100A13基因編碼區(qū)序列,構(gòu)建了其真核表達(dá)載體,該載體分別在COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)和HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)成功,S100A13基因在COS-7中亞細(xì)胞定位于胞漿而在HepG2細(xì)胞中亞細(xì)胞定位于整個(gè)細(xì)胞。S100A13及其介導(dǎo)釋放的FGF1在腫瘤的增殖及對(duì)抗癌藥物的敏感性方面均不具有明顯的作用,這可能預(yù)示著S100A13通過促進(jìn)FGF1的釋放,在腫瘤局部