CTLA4Ig基因修飾人肝細(xì)胞株L02誘導(dǎo)免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞移植是治療肝衰竭和代謝性肝病的重要手段之一,相對(duì)于肝臟移植,肝細(xì)胞移植具有來源較廣、費(fèi)用相對(duì)低廉、創(chuàng)傷較小等優(yōu)點(diǎn),可提供暫時(shí)性肝功能支持,為肝臟重建創(chuàng)造機(jī)會(huì)。但同肝移植一樣,排斥反應(yīng)影響移植肝細(xì)胞的長(zhǎng)期存活和遠(yuǎn)期療效。目前解決排斥反應(yīng)的主要策略是使用免疫抑制劑,但此類藥物毒副作用較大,需長(zhǎng)期甚至終身使用,且增加感染和腫瘤的發(fā)生率。在此背景下,誘導(dǎo)移植物免疫耐受成為研究熱點(diǎn)。
　　 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(c

2、ytotoxic T-lymphocyte associatedantigen4-immunoglobulin,CTLA4Ig)是CTLA4分子胞外功能區(qū)與免疫球蛋白IgG恒定區(qū)相結(jié)合的融合性可溶性蛋白,可與T淋巴細(xì)胞表面的CD28分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表面的B7分子,阻斷T細(xì)胞活化的共刺激通路,抑制T細(xì)胞活化,誘導(dǎo)對(duì)特異性抗原的免疫耐受。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CTLA4Ig可以有

3、效抑制排斥反應(yīng),延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間,肝細(xì)胞移植中應(yīng)用CTLA4Ig同樣被證實(shí)可有效誘導(dǎo)免疫耐受。其主要應(yīng)用方法為CTLA4Ig蛋白的全身應(yīng)用或各種載體介導(dǎo)CTLA4Ig基因的全身轉(zhuǎn)染。但此類方法同全身使用環(huán)孢霉素等傳統(tǒng)免疫抑制劑一樣,可能干擾機(jī)體整體免疫功能并導(dǎo)致非特異性免疫抑制。在此背景下,本研究利用重組腺病毒載體攜帶CTLA4Ig基因,在體外轉(zhuǎn)染正常人肝細(xì)胞株L02,使L02細(xì)胞表達(dá)具有免疫抑制生物學(xué)活性的CTLA4Ig,以期建立一

4、種通過移植肝細(xì)胞自身表達(dá)CTLA4Ig誘導(dǎo)免疫耐受的方法。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　　 一、腺病毒介導(dǎo)CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染的L02細(xì)胞生物學(xué)特性的研究
　　 以重組人CTLA4Ig腺病毒載體(Ad-CTLA4Ig-EGFP)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞株L02,觀察轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染后L02細(xì)胞對(duì)CTLA4Ig的表達(dá)以及自身生物學(xué)特性的變化。結(jié)果顯示:
　　 1.自轉(zhuǎn)染后6小時(shí)開始L02細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光表達(dá),48-7

5、2小時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)峰值,可持續(xù)較強(qiáng)表達(dá)2周,隨后逐漸衰減,28天時(shí)尚余微弱熒光;經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),重復(fù)感染度MOI為600時(shí),轉(zhuǎn)染效率約為88.0％;免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blotting檢測(cè)提示轉(zhuǎn)染后L02細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量CTLA4Ig表達(dá),且可分泌至細(xì)胞外。ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后1周時(shí)上清中CTLA4Ig濃度達(dá)峰值,約為(16.55±1.20)ng/ml。<

6、br>　　 2.經(jīng)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后初期細(xì)胞生長(zhǎng)速度稍減慢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)上清中尿素含量,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后L02細(xì)胞合成分泌尿素的能力較轉(zhuǎn)染前明顯升高(P＜0.01)。
　　 二、CTLA4Ig基因修飾的L02細(xì)胞(CTLA4-L02)體外、體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受的研究
　　 1.CTLA4-L02與SD大鼠淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后,以MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖,發(fā)現(xiàn)增值率明顯受到抑制(P＜0.05),抑制率約為36

7、.8％;經(jīng)CTLA4-L02抑制后的大鼠脾臟細(xì)胞再接受正常L02細(xì)胞刺激時(shí)僅發(fā)生輕度增殖,增值率明顯低于接受Hela細(xì)胞刺激的脾細(xì)胞(P＜0.01)。
　　 2.將CTLA4-L02經(jīng)脾臟注射移植給行2/3肝葉切除術(shù)的SD大鼠,術(shù)后第3、4周檢測(cè)鼠肝組織可見表達(dá)人白蛋白陽性的細(xì)胞存活,而注射生理鹽水及正常L02細(xì)胞的對(duì)照組為陰性;檢測(cè)術(shù)后1周的大鼠外周血發(fā)現(xiàn):1)轉(zhuǎn)染組大鼠(注射CTLA4-L02)外周血CD4+T細(xì)胞比例及激活

8、的CD4+T細(xì)胞(CD4+CD69+T細(xì)胞)比例均較未轉(zhuǎn)染組(注射L02細(xì)胞)降低(P＜0.01);2)轉(zhuǎn)染組大鼠外周血IL-2水平較未轉(zhuǎn)染組低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.腺病毒載體可介導(dǎo)CTLA4Ig基因高效率轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株L02,轉(zhuǎn)染后的L02細(xì)胞可在胞漿內(nèi)有效表達(dá)CTLA4Ig蛋白并分泌至細(xì)胞外,表達(dá)持續(xù)時(shí)間超過4周;而自身生物學(xué)特性并未受到明顯負(fù)面影響。
　　 2.轉(zhuǎn)染后的L02細(xì)胞在體外