高糖環(huán)境誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞ROS爆發(fā)—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)布比卡因神經(jīng)毒性.pdf

1、局麻藥的神經(jīng)毒性與體位所致產(chǎn)科神經(jīng)并發(fā)癥已引起關(guān)注，尤其是妊娠期糖尿病對局麻藥神經(jīng)毒性具有易感性，神經(jīng)損傷發(fā)生率有增高趨勢。另有研究證實(shí)，糖尿病患者接受椎管內(nèi)阻滯麻醉或鎮(zhèn)痛后，其發(fā)生神經(jīng)損傷的風(fēng)險(xiǎn)可明顯增加，或引發(fā)原有多發(fā)性神經(jīng)病變加重。布比卡因是臨床常用的局麻藥之一，其所致心血管及神經(jīng)毒性反應(yīng)引起高度廣泛關(guān)注。其機(jī)制尚不明了，尤其是神經(jīng)毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，布比卡因可誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygenspe

2、cies，ROS)大量增多，并激活Caspase-3（細(xì)胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的蛋白酶），觸發(fā)細(xì)胞凋亡。布比卡因觸發(fā)ROS爆發(fā)性產(chǎn)生在妊娠期糖尿病及一般糖尿病患者等高糖環(huán)境下機(jī)制是否一致？目前尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulumstress,ERS)在妊娠期糖尿病與一般糖尿病患者局麻藥神經(jīng)毒性易感性中起重要的病理生理作用。ERS是導(dǎo)致妊娠期糖尿病產(chǎn)婦局麻藥神經(jīng)毒性易感性的主要因素之一。STZ（鏈脲菌素）誘導(dǎo)的糖尿病大

3、鼠研究證明高糖環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞中ROS水平增高。局麻藥通過干擾神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，使神經(jīng)細(xì)胞原先存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)更加嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能遭到破壞，氧化應(yīng)激被高水平的線粒體電子傳遞和谷胱甘肽的消耗所惡化、加強(qiáng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)ROS毒性積累到一定程度，局麻藥的應(yīng)用觸發(fā)ROS誘導(dǎo)ROS釋放(ROS-induced ROS-release，RIRR)機(jī)制，正反饋性誘發(fā)周邊正常線粒體產(chǎn)生、釋放大量的ROS，即導(dǎo)致ROS爆發(fā)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終誘發(fā)

4、神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及造成神經(jīng)細(xì)胞的其他損傷。藉此，可推測，糖尿病或妊娠期糖尿病患者在高糖環(huán)境下與局麻藥共同作用，觸發(fā)ROS爆發(fā)。ERS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在多個(gè)環(huán)節(jié)上與其他細(xì)胞器形成功能耦聯(lián)，線粒體是ERS誘導(dǎo)凋亡的一重要細(xì)胞器。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞中由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與線粒體膜接觸緊密，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)任何微小擾動均影響到線粒體的功能發(fā)揮。在營養(yǎng)過?；虼x調(diào)控信號過程出現(xiàn)障礙時(shí)，其負(fù)荷壓力劇增，并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，可通過多種途徑損傷線粒體DNA，減少線粒體數(shù)量致其

5、功能受損，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能通過多作用位點(diǎn)與方式實(shí)現(xiàn)的。課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，局麻藥作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷的模型中，高糖培養(yǎng)組局麻藥導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率顯著增加。高糖環(huán)境造成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境異常，影響神經(jīng)細(xì)胞的代謝與機(jī)能，尤其是膜系統(tǒng)對其反應(yīng)更為敏感，細(xì)胞膜受損后細(xì)胞代謝功能下降。高糖環(huán)境使?jié)B透壓處于非生理狀態(tài)的異常，細(xì)胞膜功能及細(xì)胞器功能受損，易于受到ROS的攻擊;高糖環(huán)境導(dǎo)致線粒體

6、ROS生成增加，使細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞核進(jìn)行性損傷。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（Grp）是一類存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激蛋白，屬于SHP90家族，為駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志分子伴侶，具有多種重要的生物學(xué)功能。在ERS早期，Grp78是發(fā)揮抵御機(jī)制的重要成員，增加細(xì)胞的生存力，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)及阻止其應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 本研究對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高糖環(huán)境觸發(fā)ERS及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡影響，證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)ROS毒性積累;在局麻藥作用下S

7、H-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多。為糖尿病與妊娠期糖尿病患者接受局麻藥麻醉后神經(jīng)毒性易感的分子機(jī)制提出新的理論，也為糖尿病產(chǎn)婦出現(xiàn)產(chǎn)科神經(jīng)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理提供新的線索，及防治神經(jīng)并發(fā)癥提供新的靶點(diǎn)。本研究構(gòu)建Grp78基因過表達(dá)慢病毒載體質(zhì)粒，并構(gòu)建含有目的基因的表達(dá)克隆質(zhì)粒和針對靶基因不同干擾靶點(diǎn)的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染形成RNA干擾有效靶點(diǎn)的重組質(zhì)粒;分別感染SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)節(jié)Grp78基因在SH-SY5

8、Y細(xì)胞中的表達(dá)，研究布比卡因是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激由于Grp78功能減弱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)和細(xì)胞凋亡增加。進(jìn)一步明確通過調(diào)節(jié)Grp78基因的過表達(dá)來降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。本研究分為六個(gè)部分：
　　 第一章：高糖培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞ROS增多與凋亡增加。
　　 目的：探討SH-SY5Y細(xì)胞在高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)ROS增多和凋亡增加情況。
　　 方法：不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，

9、采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量及細(xì)胞凋亡量，MTT法檢測細(xì)胞存活率，Western blotting技術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)GRP78相關(guān)蛋白的變化。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。細(xì)胞存活率、ROS含量和細(xì)胞凋亡率采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：各組細(xì)胞經(jīng)含糖培養(yǎng)液培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)

10、ROS含量逐漸增多，具體表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)的ROS含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 細(xì)胞相對存活率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，OD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。組間OD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。免疫印跡結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)GRP78表達(dá)增強(qiáng)，隨著應(yīng)激增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增加及細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)

11、制的作用，GRP78表達(dá)維持在一定范圍以維系細(xì)胞生存。6.1 mmol/L組(0.88±0.04)、7.0mmol/L組(0.97±0.05)、7.8mmol/L組(0.83±0.04)和11.1mmol/L組(0.94±0.05)GRP78表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的進(jìn)一步增強(qiáng)，GRP78表達(dá)降低(0.26±0.06)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：細(xì)胞ROS增多及導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與高糖環(huán)境引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

12、有關(guān)。
　　 第二章：布比卡因致高糖培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞ROS增多與凋亡增加。
　　 目的：探討布比卡因作用于高糖培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS增多和凋亡增加情況。
　　 方法：不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SHSY-5Y細(xì)胞，經(jīng)1mmol/L布比卡因作用6h。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量及細(xì)胞凋亡狀況、MTT法檢測細(xì)胞存活率、Western blotting技術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)GRP78相關(guān)蛋白的變化。計(jì)量

13、資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。細(xì)胞存活率、ROS含量、細(xì)胞凋亡率和GRP78相關(guān)蛋白的變化采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：各組含不同濃度糖培養(yǎng)基的細(xì)胞經(jīng)布比卡因作用6h檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。在葡萄糖濃度為5.56mmol/L、6.1 mmol/L、7mmol/L組間ROS含量差異無統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。葡萄糖濃度為7.8 mmol/L、11.1mmol/L和13.3 mmol/L時(shí)，各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)布比卡因作用6h后，各組細(xì)胞相對存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。組間差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)布比卡因作用6h后各組細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。組間細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Western blot檢測結(jié)果，單獨(dú)效

15、應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)在布比卡因處理6h后，5.56mmol/L組和6.1mmol/L組分別為1.02±0.12和0.97±0.06，均高于7.0mmol/L組（0.39±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。7.8mmol/L組（0.98±0.06）高于7.0mmol/L組（0.39±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。5.56mmol/L組、6.1mmol/L組和7.8mmol/L組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1

16、1.1 mmol/L組與其他各組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：細(xì)胞ROS增多及導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加與布比卡因進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，引起細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。Grp78功能減弱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步加強(qiáng)。
　　 第三章：布比卡因增強(qiáng)高糖培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性。
　　 目的：探討布比卡因?qū)Ω咛黔h(huán)境下的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用。
　　 方法：不同濃度

17、葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞及經(jīng)1mmol/L布比卡因作用6小時(shí)，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量及細(xì)胞凋亡狀況、MTT法檢測細(xì)胞存活率、Western blotting技術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)GRP78相關(guān)蛋白的變化。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。細(xì)胞存活率、ROS含量和細(xì)胞凋亡率采用兩因素析因設(shè)計(jì)資料方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）

18、。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：除糖濃度6.1mmol/L和7mmol/L組外，布比卡因作用高糖環(huán)境下的SH-SY5Y細(xì)胞前后細(xì)胞內(nèi)ROS檢測，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。布比卡因作用高糖環(huán)境下的SH-SY5Y細(xì)胞前后細(xì)胞存活率檢測，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Western Blot檢測布比卡因作用高糖環(huán)境下的SH-SY5Y細(xì)胞前后各組細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。<

19、br>　　 結(jié)論：高糖環(huán)境引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞ROS增多及細(xì)胞凋亡增加。布比卡因的應(yīng)用進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。
　　 第四章：Grp78基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建和包裝及鑒定。
　　 目的：探討Grp78基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建和包裝及鑒定。
　　 方法：運(yùn)用慢病毒載體GV261，采用基因工程技術(shù)，獲取目的基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化，對陽性克隆進(jìn)行

20、測序。最后對慢病毒包裝和滴度檢測。
　　 結(jié)果：陽性克隆測序比對結(jié)果說明測通。熔解曲線沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬。表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。Grp78基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建和包裝成功。
　　 結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與Grp78功能減弱關(guān)系密切，Grp78基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建和包裝成功為研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中Grp78的功能獲取良好的研究工具，可進(jìn)一步論證Grp78對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。
　　

21、 第五章：RNAi慢病毒外源篩靶與內(nèi)源驗(yàn)證。
　　 目的：制備含目的基因（Grp78基因）過表達(dá)敲減的RNAi慢病毒載體重組質(zhì)粒。
　　 方法：通過RNAi慢病毒載體制備和目的基因過表達(dá)載體構(gòu)建、過表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)檢測，最后行Western blot外源篩選有效RNAi載體。通過上述實(shí)驗(yàn)流程得到含目的基因表達(dá)敲減的RNAi慢病毒載體重組質(zhì)粒，RNAi慢病毒大量包裝，通過Real time PCR驗(yàn)證內(nèi)源性目的基因表達(dá)敲減。

22、
　　 結(jié)果：HSPA5-RNAi(8747-2)靶點(diǎn)對目的基因的表達(dá)有敲減作用，因而是有效靶點(diǎn)。通過基因工程成功制備含目的基因（Grp78基因）過表達(dá)敲減的RNAi慢病毒載體重組質(zhì)粒。
　　 結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與Grp78功能減弱關(guān)系密切，Grp78基因過表達(dá)敲減的RNAi慢病毒載體重組質(zhì)粒構(gòu)建和包裝成功為研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中Grp78的功能獲取良好的研究工具，可進(jìn)一步論證Grp78對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。
　　 第六章

23、：布比卡因?qū)Ω咛桥囵B(yǎng)Grp78基因過表達(dá)/干擾SH-SY5Y細(xì)胞毒性的作用。
　　 目的：探討Grp78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用。
　　 方法：不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)Grp78基因過表達(dá)和干擾的SH-SY5Y細(xì)胞及經(jīng)1mmol/L布比卡因作用6h，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量及細(xì)胞凋亡情況。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。細(xì)胞內(nèi)ROS含量和細(xì)胞凋亡率采用多因素析因設(shè)計(jì)

24、資料方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：細(xì)胞內(nèi)ROS檢測及細(xì)胞凋亡情況，Grp78基因過表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞較Grp78基因正常表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而Grp78基因干擾的SH-SY5Y細(xì)胞較Grp78基因正常表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：G