結(jié)直腸癌IGFBP7基因異常甲基化的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在西方經(jīng)濟發(fā)達國家，結(jié)直腸癌的死亡率位于惡性腫瘤的第二位；在我國，其死亡率位于第四位左右。近二十年來，結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率總體上呈上升趨勢，并且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率還會繼續(xù)上升。盡管相對于其它腫瘤而言，結(jié)直腸癌的發(fā)病機制研究得比較深入，但其診治方法仍未獲突破性進展，進展期結(jié)直腸癌的五年生存率仍未得到根本性提高，因此積極開展結(jié)直腸癌發(fā)生機制的研究對于結(jié)直腸癌的防治具有很

2、重要的現(xiàn)實意義。 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-likegrowthfactorbindingprotein7，IGFBP7)基因是我們實驗室通過抑制性差減雜交法從結(jié)腸腺癌-正常粘膜的差減cDNA文庫中篩出并在結(jié)腸腺癌中高表達的一個基因。IGFBP7在人體內(nèi)多種組織、器官中廣泛表達，但在多種人類腫瘤中表達下調(diào)，如乳腺癌、腦膜瘤、肝癌、前列腺癌等。IGFBP7在結(jié)直腸癌中的相關(guān)研究不多?，F(xiàn)有的文獻均支持IGFBP7在

3、結(jié)直腸癌組織中的表達較正常組織更高，但在絕大多數(shù)結(jié)腸癌細胞系中表達缺失。IGFBP7在體內(nèi)、外結(jié)直腸癌細胞及在不同腫瘤組織中的差異表達提示，很可能存在一個可逆的調(diào)控機制調(diào)節(jié)該基因的表達。因此，深入開展結(jié)直腸癌IGFBP7表達調(diào)控機制的研究，將有助于進一步明確IGFBP7在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為結(jié)直腸癌的預防和治療提供切入點。 基因的表達調(diào)控主要通過遺傳學(genetics)和表遺傳學(epigenetics)兩種機制實現(xiàn)

4、。遺傳學機制只能解釋腫瘤發(fā)病機制中的一部分原因，還有許多具有重要功能的基因是通過表遺傳學機制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表遺傳學改變是一種不涉及核苷酸序列變化的可遺傳的基因表達方式的改變。DNA甲基化是其中研究得最深入的作用方式，與抑制基因的表達有關(guān)。DNA異常甲基化的檢測已成為研究腫瘤發(fā)生機制的分子熱點之一。但目前對甲基化的研究局限于CpG島中少數(shù)幾個CG位點，通過檢測整個5'端CpG島甲基化狀態(tài)篩選表達調(diào)控相關(guān)的甲基化熱點或區(qū)段的研究則鮮

5、有報道。 與遺傳學改變不同的是，表遺傳學是一個可逆的化學修飾過程，因此可作為腫瘤治療的靶點。例如，使用去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase1，DNMT1)的活性，使因甲基化而表達抑制的基因恢復表達，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性表型。 本課題的目的是研究IGFBP7基因在結(jié)直腸癌中的表達調(diào)控機制，重點

6、闡明5'端CpG島異常甲基化對IGFBP7基因表達調(diào)控的影響。我們采用RT-PCR法檢測IGFBP7基因在本實驗室保存的10個結(jié)腸癌細胞株中mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)僅SW480和Caco2表達IGFBP7，而SW620、Hce8693、CW2、COLO205、HT29、HCT8、SW1116和RKO等8個細胞株中檢測不到IGFBP7表達。對10個結(jié)腸癌細胞株IGFBP7基因的啟動子序列和所有5個外顯子序列進行PCR擴增并測序，結(jié)果顯示，SW

7、480和SW620在啟動子區(qū)域-181位存在G/A變化，Caco2和COLO205在第一外顯子+53位存在C/T變化，經(jīng)NCBI檢索發(fā)現(xiàn)，這兩個位點均是單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位點。生物信息學分析未發(fā)現(xiàn)這兩個SNP位點對IGFBP7的重要生物學功能有影響。由于IGFBP7在SW480和Caco2中表達陽性，而在SW620和COLO205中表達陰性，這兩個位點的堿基改變應與基因表達

8、關(guān)系不大。上述研究結(jié)果提示，遺傳學改變(核苷酸序列變化)可能不是IGFBP7基因表達調(diào)控的主要機制。因此，有必要對表遺傳學改變在IGFBP7表達調(diào)控中所起的作用進行研究。 在線軟件分析結(jié)果顯示IGFBP7基因的5'端有一個CpG島，長約1200bp，覆蓋啟動子區(qū)域、第一外顯子和部分第一內(nèi)含子序列。該CpG島含有135個CpG位點，這些CpG位點的異常甲基化都可能參與IGFBP7基因的表達調(diào)控。因此，我們首先采用亞硫酸氫鈉-測序P

9、CR法(bisulfitesequencingPCR，BSP)對該基因5'端CpG島中所有CpG位點的甲基化情況進行檢測。為尋找與基因表達相關(guān)的甲基化特異性區(qū)段，對所獲得的10個細胞株IGFBP7基因5'端CpG島中135個CpG位點的甲基化水平進行聚類分析。結(jié)果顯示，IGFBP7基因第一外顯子在IGFBP7表達陽性和陰性的細胞株之間存在顯著的甲基化差異(P＜0.05)，而啟動子區(qū)序列和第一內(nèi)含子序列的甲基化情況在IGFBP7表達陽性與

10、陰性的細胞株間差別不明顯，提示第一外顯子的異常甲基化很可能與表達關(guān)系密切。根據(jù)這一結(jié)果，我們在IGFBP7第一外顯子區(qū)域進行甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)檢測。結(jié)果顯示，IGFBP7第一外顯子CpG島序列在IGFBP7表達陽性的SW480和Caco2細胞中未甲基化，而在IGFBP7表達陰性的的其余幾個細胞株中則發(fā)生甲基化改變(完全甲基化或部分甲基化)。IGFBP7基因在結(jié)腸癌細胞株中的表達水平

11、與其第一外顯子的甲基化水平呈明顯的負相關(guān)。 為進一步驗證DNA甲基化是結(jié)腸癌IGFBP7基因表達調(diào)控的直接機制，我們用去甲基化藥物5-aza-dC處理結(jié)腸癌細胞株SW620、COLO205和HT29，分別采用RT-PCR、免疫細胞化學染色法檢測藥物處理前后結(jié)腸癌細胞中IGFBP7mRNA和蛋白表達，MSP法檢測IGFBP7基因第一外顯子甲基化狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示，5-aza-dC處理后的結(jié)腸癌細胞中IGFBP7mRNA和蛋白均恢

12、復表達，MSP法檢測證實該基因發(fā)生了去甲基化改變，提示IGFBP7在這些結(jié)腸癌細胞中表達的恢復是該基因去甲基化的直接作用，表明DNA異常甲基化是結(jié)腸癌IGFBP7表達改變的直接調(diào)控機制。同時，我們還采用MTT實驗、流式細胞術(shù)、遷移實驗和transwell小室侵襲實驗等方法檢測5-aza-dC處理后結(jié)腸癌細胞的增殖能力、細胞周期和凋亡、遷移及侵襲能力的改變。研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理組結(jié)腸癌細胞較對照組細胞的生長增殖能力顯著下降、細胞周期阻滯、凋

13、亡細胞數(shù)明顯增加、細胞的遷移和侵襲能力均受到抑制(P＜0.05)。結(jié)合IGFBP7的表達變化，我們推測IGFBP7表達的恢復很可能參與了5-aza-dC處理所引起的結(jié)腸癌細胞上述生物學行為的改變。 為進一步研究IGFBP7基因第一外顯子異常甲基化與該基因表達的關(guān)系，我們檢測了46例結(jié)直腸癌組織及配對的正常粘膜中IGFBP7基因第一外顯子的甲基化情況，并結(jié)合其表達進行分析。結(jié)果提示結(jié)直腸癌組織IGFBP7的甲基化率低于配對的正常組

14、織(P＜0.05)；IGFBP7基因第一外顯子的甲基化情況與其表達之間存在負相關(guān)性(P＜0.05)，與體外細胞系的結(jié)論一致。 綜合上述研究結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：1.結(jié)直腸癌中，IGFBP7基因的5'端CpG島存在異常甲基化，并且第一外顯子的異常甲基化與該基因的表達呈負相關(guān)。DNA異常甲基化是結(jié)直腸癌IGFBP7基因表達改變的主要調(diào)控機制，為IGFBP7在結(jié)直腸癌體內(nèi)、外的差異表達提供了理論依據(jù)。 2.去甲基化藥物5-a

15、za-dC在誘導結(jié)腸癌細胞IGFBp7基因去甲基化、恢復基因表達的同時，還有抑制結(jié)腸癌細胞的生長、阻滯細胞周期、促進細胞凋亡、抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力等方面的作用。IGFBP7表達的恢復很可能在上述5-aza-dC處理所引起的結(jié)腸癌細胞生物學行為改變中發(fā)揮一定的作用。 3.運用亞硫酸氫鈉-測序法(BSP)結(jié)合聚類分析可以有效地尋找與基因表達相關(guān)的甲基化特異性區(qū)段，結(jié)合甲基化特異性PCR法(MSP)可快速驗證該特異區(qū)段DNA