鋅脂蛋白A20抑制TLR4介導的人單細胞炎癥反應的實驗研究.pdf

1、目的： 應用TLR4特異性激動劑脂多糖(LPS)刺激體外培養(yǎng)的人單核細胞，激活TLR4/NF-κB信號途徑，將含有A20基因的質粒轉染入單核細胞進行干預，觀察A20過表達后單核細胞膜受體TLR4表達的變化，以及對下游促炎因子TNF-α、IL-12及抗炎因子IL-10表達的調節(jié)，并進一步研究A20過表達對促炎因子/抗炎因子即TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10比率的影響，以探討鋅脂蛋白A20對單核細胞炎癥反應的保護作用及

2、可能的調節(jié)機制。 方法： 外周血經(jīng)EDTA抗凝，F(xiàn)icoll細胞分離液分離外周血單個核細胞，將單核細胞貼壁培養(yǎng)于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調整單核細胞濃度為1×105個/ml，實驗設A組(為空白對照組，培養(yǎng)液中不加任何干預因素)；B組(為LPS組，無血清培養(yǎng)48小時，在培養(yǎng)基中加入1mg/L的LPS作用24小時)；C組(為A20轉染組，無血清培養(yǎng)24小時，轉染pCAGGS-GFP/A20質粒陽離子脂質體復合物

3、培養(yǎng)48小時)；D組(為LPS+A20轉染組，無血清培養(yǎng)24小時，轉染pCAGGS-GFP/A20質粒陽離子脂質體復合物培養(yǎng)48小時，于轉染過程中加入1mg/L的LPS作用24小時)。胰酶消化法收集以上各組單核細胞；采用免疫熒光方法檢測GFP報告基因，免疫組化檢測A20蛋白的表達；提取總mRNA用RT-PCR檢測內源性A20、外源性A20及TLR4的mRNA表達；應用流式細胞檢測技術檢測TLR4的表達，以CD14+為單核細胞標記，采用未