抗人間充質干細胞（MSCs）單克隆抗體的制備及其生物學特性研究.pdf

1、人骨髓間充質干細胞(humanMesenchymalStemCells，hMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的干細胞群體，是近年來干細胞研究領域的一個熱點。hMSCs是組織工程和再生醫(yī)學的理想種子細胞，在臨床具有廣闊的應用前景。 近十年來干細胞生物學研究領域的突破，使人們對hMSCs的生物學特性有了較深入的認識，但迄今為止尚未發(fā)現其特異表面膜標志，現行的分離方法主要是根據hMSCs的生長特性、表型特征和所具有

2、的多向分化潛能進行評判，影響因素多，操作繁瑣，費用昂貴，所得細胞均一性尚不理想，且不同實驗室之間數據的可比性差。因而人們一直在努力尋找特異的hMSCs的標記分子。 本研究以分離培養(yǎng)的hMSCs免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術制備抗hMSCs的單克隆抗體，并通過間接免疫熒光、免疫組織化學及流式細胞術等方法對其生物學特性作了初步的鑒定，并以制備的單克隆抗體作探針，用于hMSCs的分選及表面特異性膜分子研究。 實驗方法

3、1.hMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定：從正常健康供者獲取骨髓，以Ficoll-paque分離液分離獲取單個核細胞層經培養(yǎng)后，棄去非貼壁細胞，以10％胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，所得細胞用流式細胞儀檢測其表型。 2.抗hMSCs單克隆抗體的制備：采用多供體(2份以上供者)hMSCs以0.01MpH7.2PBS懸浮免疫BALB/C小鼠，每只0.2ml(1.0×106)腹腔注射，每周1次，共4次，于融合前3天加強免疫一次。取免疫

4、小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0在50％PEG(MW4000)作用下融合，用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。以改良的間接免疫熒光法篩選抗體。選擇陽性克隆進行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，直至抗體陽性率達100％，雜交瘤細胞接種于經液體石蠟處理過的BALB/C小鼠腹腔，兩周左右后收集腹水，以間接免疫熒光測腹水效價，又以免疫金層析法測定單克隆抗體的類別.用鹽析法和DEAE纖維素離子交換純化，SDS-PAGE鑒定純度。 3.抗hM

5、CSs單抗的生物學特性檢測：采用間接ELISA測定5株單抗的親和力，并進行表位結合分析，用間接免疫熒光法檢測了外周血淋巴細胞、HL-60、Raji、血管內皮細胞及大鼠間充質干細胞與單抗的交叉反應；又以免疫組織化學法檢測了5株單抗在肌肉、骨髓神經等12種組織標本中的表達。 4.應用：(1)建立免疫磁珠分選hMCSs通過正向免疫磁珠分選骨髓單個核細胞，繼而用流式細胞術檢測其純度及表型特征，并對篩選后的細胞作分化能力進行研究。(2)單

6、抗的熒光標記用FITC直標純化后的單抗，用于hMCSs的鑒定。 結果 1.hMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定：分離所得hMSCs經傳代培養(yǎng)，棄去非貼壁細胞后，得較純hMSCs，以流式細胞儀檢測其表型為CD29+、CD44+、CD166+、CD34-、CD45-、HLA-DR-。 2.抗hMSCs單克隆抗體的制備：以分離培養(yǎng)的hMSCs免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合。在融合的1248孔

7、中，經間接免疫熒光法篩選到陽性雜交瘤27孔，上述陽性孔細胞作適當擴大培養(yǎng)后，液氮保存。在27個陽性雜交瘤孔中取10孔進行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，結果獲得能穩(wěn)定分泌抗hMSCs單克隆抗體雜交瘤細胞5株，定名為ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUE12和ZUF10。上述細胞株經3次以上克隆化培養(yǎng)，在體外持續(xù)培養(yǎng)6月余，分泌抗體性能穩(wěn)定，凍存、復蘇后細胞生長良好。5株單抗效價(腹水)均＞106，單抗的類別除ZUC3為IgMκ外，其余4株均為IgG1

8、κ。 3.特性檢測：5株單抗的相對親和力分別為：ZUB1：1×106、ZUB4：1×105、ZUC3：1×106、ZUE12：1×105、ZUF10：1×105。表位分析的結果提示ZUB1、ZUE12、ZUF10針對相同的表位，ZUC3及ZUB4則分別針對不同的表位，用間接免疫熒光法將5株單克隆抗體分別與外周血淋巴細胞、HL-60、Raji、血管內皮細胞及大鼠MSCs作交叉反應，同時以免疫組織化學法檢測了12個間充質和非間充質來

9、源的組織標本，以hMSCs作陽性對照，結果5個單克隆抗體除ZUC3對大鼠來源的MSCs有反應外，其余均未見交叉反應 4.應用：通過建立的正向免疫磁珠分選法對骨髓單個核細胞進行分選，7-10×107人骨髓單個核細胞可獲得4-5×105細胞，此群細胞CD29、CD44、CD105、CD166陽性，造血細胞分化抗原則為陰性，并具有向多種細胞分化的潛能。 結論 本研究制備了5株特異性針對hMSCs表面膜分子的單克隆抗體，為尋找