小腸上皮細胞培養(yǎng)

1、腸上皮細胞,腸上皮細胞（intestinal epithelial cells,IECS）是具有極性的柱狀上皮細胞，參與腸道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和應激反應等，黏膜上皮內(nèi)含有大量的免疫細胞和免疫分子，是機體內(nèi)最大的免疫組織。IEC是體內(nèi)更新最快的一類細胞，對維持腸上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成為研究細胞增殖和分化調(diào)控機制、營養(yǎng)素對腸上皮的作用、細胞信號轉(zhuǎn)導、腸道免疫等提供了理想的體外模型。,膠原酶Ⅳ消化法得到的兔

2、IEC,雞胚盲腸上皮細胞呈鋪石路生長（400×）,準備工作,1、對所需用到的器皿的清洗、干燥、消毒2、培養(yǎng)基和其他試劑的配制、分裝及滅菌3、無菌室或超凈臺的清潔與消毒4、培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試,IEC的培養(yǎng)流程,幼齡動物小腸,→,單個細胞,→,細胞懸液,→,細胞貼壁生長,→,細胞懸液,→,細胞株或細胞系,剪碎,胰蛋白酶,原代培養(yǎng),胰蛋白酶,傳代培養(yǎng),IEC的培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。分離細胞后立即進行培養(yǎng)稱為原

3、代培養(yǎng)，一般將培養(yǎng)的第1代與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)；存活的原代培養(yǎng)細胞（細胞株）進行傳代，稱為傳代細胞培養(yǎng)。,影響IEC培養(yǎng)的因素,1、材料來源以取自剛出生且未進奶的新生大鼠最好。對已進食的新牛大鼠，分離培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)液、細胞洗滌液(Hanks液)和組織分散液中均應加入2倍濃度的抗生素。2、消化酶的選擇用0．25％胰酶消化組織，室溫下需約1 h，分離得到的大部分為單個細胞，貼壁和生長能力均較差。膠原酶Ⅺ與

4、中性蛋白酶I的聯(lián)合使用，室溫消化約40 min即可得到IEC團塊，其貼壁能力較強，牛長狀態(tài)良好，還可減輕對細胞毒性損害，縮短消化作用時間，且腸絨毛細胞團的產(chǎn)率較高。用嗜熱菌蛋白酶作為分離IEC的消化酶，經(jīng)簡便純化，即可獲得較純的IEC。,3、血清濃度使用胎牛血清濃度不宜過高，10%-20%胎牛血清常使非腸黏膜上皮細胞增殖。IEC體外培養(yǎng)所用的胎牛血清的濃度一般不超過5%。4、IEC的純度 少量異源細胞的存活對IEC生長繁殖也是

5、重要的，因為IEC與間質(zhì)細胞存在相互作用關(guān)系。同時應防止其過度繁殖，如降低FCS濃度可減少成纖維細胞和平滑肌細胞增殖。應用肝素可抑制平滑肌樣細胞生長，促進IEC生長增殖。,5、培養(yǎng)基培養(yǎng)基以新鮮配制為佳，低溫(4℃)儲存不宜超過1周。EGF對于促進IEC貼壁十分重要，它與胰島素合用可促進IEC生長繁殖。生長基中加入表皮生長因子、胰島素和谷氨酰胺等更利于原代培養(yǎng)的上皮細胞生長。6、酸堿度最適pH因細胞不同及動物種屬不同而異。

6、最適pH有利于細胞本身的酶及其他生長因子發(fā)揮較好的效果，從而影響體外培養(yǎng)細胞的生存。IEC培養(yǎng)最適pH值為7．2～7．4。,IEC的鑒定,用消化酶分離培養(yǎng)的細胞僅憑光學顯微鏡形態(tài)學觀察不能鑒定為IEC，尚需其他較為特意的鑒定方法。1、堿性磷酸酶染色法 影響因素多，陽性率低。2、電鏡法 用電子顯微鏡掃面觀察細胞橋粒和刷狀緣是鑒定上皮細胞很有效的方法，但價格昂貴。3、免疫熒光法 采用特異的抗人上皮細胞膜抗原或角蛋白，特