基于角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型的眼用制劑角膜透過性及毒性研究.pdf

1、目前對(duì)于眼用制劑角膜透過機(jī)制及毒性研究，傳統(tǒng)的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體角膜－擴(kuò)散池法，存在處死動(dòng)物數(shù)量多、個(gè)體差異大等缺點(diǎn)。細(xì)胞水平的篩選及評(píng)價(jià)已漸漸成為研究的熱點(diǎn)。本文的目的是采用人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型(HCECs)對(duì)模型藥物的角膜透過性及毒性進(jìn)行研究，對(duì)眼用制劑細(xì)胞水平的研究和評(píng)價(jià)方法進(jìn)行探索。
　　 一、建立了用于藥物角膜透過性研究的角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型，并應(yīng)用于模型藥物6-羧基熒光素和羅丹明B的角膜透過性研究。將HCECs 接

2、種于Transwell-clear 培養(yǎng)板，采用DMEM/F-12 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，通過MilliporeMillicell-ERS電阻儀測(cè)定不同時(shí)間的細(xì)胞跨膜電阻值，觀察其細(xì)胞形態(tài)，評(píng)價(jià)了該細(xì)胞模型的致密性及細(xì)胞間緊密連接，測(cè)定模型藥物6-羧基熒光素和羅丹明B對(duì)角膜上皮細(xì)胞的滲透值。結(jié)果顯示，跨膜電阻值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，15d 達(dá)到最大值，約為180 Ω·cm2。此時(shí)通過顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞長(zhǎng)成致密的復(fù)層結(jié)構(gòu)。滲透性實(shí)驗(yàn)表明，

3、親水性6-羧基熒光素和親脂性羅丹明B在HCECs 角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型的滲透系數(shù)分別為(1.12±0.40)×10-6cm·s-1和(18.30±3.05)×10-6cm·s-1，滲透性比值為16。在離體兔角膜模型測(cè)得的滲透系數(shù)分別為(1.07±0.50)×10-6cm·s-1和(25.40±7.03)×10-6cm·s-1，滲透性比值為24。表明HCECs 角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型具備角膜細(xì)胞的完整性、致密性以及胞間緊密連接，可用于藥物角

4、膜透過性評(píng)價(jià)。
　　 二、建立了用于細(xì)胞毒性研究的角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型，并應(yīng)用于新型藥物載體樹狀大分子PAMAM及葛根素對(duì)角膜上皮細(xì)胞的毒性研究。采用WST-1法分別測(cè)定了PAMAM、葛根素、葛根素-PAMAM 復(fù)合物及葛根素脂質(zhì)體在不同濃度和不同時(shí)間對(duì)HCECs的細(xì)胞存活率的影響及各自的IC50值。結(jié)果表明，隨著PAMAM 代數(shù)的增加，角膜上皮細(xì)胞毒性增加，在一定濃度范圍之內(nèi)角膜上皮細(xì)胞毒性隨著藥物濃度的增加而增加，且角膜上皮