杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥dmd與遺傳

1、,蛋白結(jié)構(gòu)缺陷引起的疾病Maladies dues aux défauts des proteins de structure,——Dystrophies musculaires de Duchenne et Becker,,疾病概述,,Dystrophie musculaire de Duchenne,DMD，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良，假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良Dystrophine（Dys） 抗肌萎縮蛋白 缺失Maladie

2、monogeniqueHétédité: XRDuchenne, un neurologiste français, a donné une description complète de 13 maladies attaints,Phénotype Clinique de la DMD,Les muscles jumeaux des jambs des gar

3、çons atteints apparaissent qu’ils soient développésMais asthéniques假性肌肥大Tissu conjonctif et la graisse,Phénotype Clinique de la DMD,1~2 ans normal3 ~ 5 ans

4、 développe une faiblesse musculaire Dès l’âge de 12 ans confiné en chaise roulant Au-delà de l’âge de 20 ans ne survivraQI 智商 une chute mod&

5、#233;ré d’environ 20 points,,LabCréatine kinase (niveau sérique)血清濃度 50~ 100 fois la limite supérieure de la normale dans les stades préco

6、ces,Dystrophie musculaire de Becker,le gène de la dystrophie Beaucoup plus atténué 緩和 Après l’âge de 16 ans parvient à marcher 之后多年也可行走,DMD與BMD的差異,DMD——致死BMD——存活率非常高(70%),易產(chǎn)生

7、 新的突變,,遺傳,,遺傳特征,Hétédité: XR,遺傳特征,（1）系譜中常常只有男性患者（2）父母都無(wú)病時(shí)，女兒則不會(huì)發(fā)病，兒子可能發(fā)??；（3）由于交叉遺傳，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常為本病患者；（4）由于男性患者的子女都正常，故可見(jiàn)隔代遺傳；（5）女性患者的父親一定是患者,母親一定是攜帶者。,DMD —男女差異,男性致死1/3 néomutation,2/3 m&

8、#232;re porteuse女性攜帶者 Majorité 無(wú)任何臨床表現(xiàn)，70% 肌酸激酶(Créatine kinase ) 增高8% 輕微的肌肉癥狀,有些還有嚴(yán)重的近心端肌肉障礙。女性很少患有DMD,母系鑲嵌,某男性是家族中DMD的先證者他的母親沒(méi)有攜帶突變基因遺傳位點(diǎn)上發(fā)生了新近的突變大約5%-15%的這些發(fā)生的例子是由于母系生殖鑲嵌,DMD —發(fā)病率較高,Garçons nou

9、veau-nés：1/3300Un taux de mutation ：1/10000每天一個(gè)男性每11-12秒會(huì)產(chǎn)生1個(gè)新突變的精子（8 x 107 par jour）,,基因與蛋白,,Gène DMD,人類最大的基因之一，2300 kb 位于Xp??占X 染色體全長(zhǎng)的1.5%99% 的序列由內(nèi)含子組成編碼區(qū)包括79個(gè)外顯子及7 個(gè)組織特異性的啟動(dòng)子其mRNA 序列長(zhǎng)114 kb主要表達(dá)于骨骼肌、

10、心肌，少量表達(dá)于腦組織,7 個(gè)組織特異性的啟動(dòng)子,,B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S(施旺細(xì)胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官)B 型：大腦皮層、海馬回神經(jīng)元P型：小腦蒲肯野細(xì)胞, 在骨骼肌也有極少量的表達(dá)M 型：骨骼肌、心肌組織, 同時(shí)在腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá),Dystrophin 抗肌萎縮蛋白,全長(zhǎng)型dystrophin 是一種427 kDa的棒狀蛋白,

11、長(zhǎng)約150 nm, 分為4 個(gè)區(qū)域，氨基端區(qū)域中央棒狀區(qū)富含半胱氨酸區(qū)域羧基端區(qū)域,,A. 位于Xp21, 黑色的豎線代表分布于整個(gè)基因上的79 個(gè)外顯子, 黑色箭頭指示各組織特異性啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)位點(diǎn), 分別以不同的字母縮寫(xiě)來(lái)代表, B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S( 施旺細(xì)胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官) 。B. 不同形式的dystrophin 蛋白及

12、其區(qū)域組成, 氨基端、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域,,DMD患者：60%基因突變表現(xiàn)為缺失一般在基因的5’端和中央棒區(qū)兩個(gè)區(qū)域BMD患者：可能缺失了一個(gè)或者幾個(gè)基因序列dystrophine蛋白的特點(diǎn)DMD患者體內(nèi)很少或者沒(méi)有BMD患者體內(nèi)有表達(dá)，但是仍然比正常人少,,,臨床治療,,DMD治療,目前為止尚無(wú)治療DMD的有效方法藥物治療（對(duì)癥治療）：糖皮質(zhì)激素治療短期口服激素治療可增強(qiáng)骨骼肌力量和功能，并可能在

13、更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定骨骼肌力量和功能基因治療：利用不直接引起人類疾病，免疫原性較小的腺相關(guān)病毒（AAV）為載體，導(dǎo)入人工剪裁的Dys基因修正肌肉組織(占全身體重40％)的基因缺陷遇到各種各樣的困難康復(fù)治療、矯形治療、社會(huì)心理治療等,,臨床檢測(cè),,產(chǎn)前診斷和雜合子診斷,90%攜帶者孕婦中產(chǎn)前診斷可能有至少95%的精確度由于基因突變導(dǎo)致基因的缺失或者多倍體的家庭中，60%-70%可以直接通過(guò)southern印跡雜交技術(shù)或者PCR技術(shù)來(lái)測(cè)量

14、胎兒的DNA得到在其余的基因缺失不能明確診斷出來(lái)的家庭中，可以通過(guò)鍵的標(biāo)記來(lái)完成產(chǎn)前診斷與患病男性結(jié)婚的女性中75%的女性：DNA檢查、CK血清濃度檢查——胎兒是否攜帶25%女性難檢測(cè)：第一，在病程的一些時(shí)期，基因缺陷是無(wú)法被檢查出來(lái)的（可能情況就是等位基因是正常的或者突變的等位基因位于另外一條X染色體上）第二，一些家庭的一些成員的樣本丟失了第三，兩個(gè)標(biāo)記基因之間的基因重組在X染色體傳入下一代之前發(fā)生了（母系鑲嵌）,產(chǎn)前檢

15、測(cè),生物化學(xué)檢查——CK血清濃度基因診斷多重PCRSouthern blot探針連接多重?cái)U(kuò)增(MLPA)變性高效液相色譜(DHPLC)抗肌萎縮蛋白的免疫組化,多重PCR方法——DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù),可直接檢出DMD／BMD的缺失型突變65％的患者為基因缺失所致多重PCR:使用多對(duì)引物的針對(duì)DMD基因的缺失熱區(qū)，利用多對(duì)PCR引物在一個(gè)PCR管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)外顯子，通過(guò)和正常對(duì)照相比較而判斷外顯子的缺失情況

16、,多重PCR方法,優(yōu)點(diǎn)：1、具有敏感、特異性強(qiáng)和可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)2、需要的DNA量少、操作簡(jiǎn)單局限性:1. 女性攜帶者——正常x染色體的屏蔽效應(yīng)，無(wú)法檢出2.多重PCR體系內(nèi)，由于引物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)個(gè)別片段擴(kuò)增的假陰性結(jié)果。（對(duì)初次擴(kuò)增呈陰性結(jié)果的片段進(jìn)行再次擴(kuò)增，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性）,Southern blot方法——DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù),是一種常用的DNA定量的分子生物學(xué)方法原理將待測(cè)的DN

17、A樣品固定在固相載體(硝酸纖維膜或尼龍膜)上與同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的有無(wú)、強(qiáng)弱可以對(duì)樣品定性、定量，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù),Southern blot方法,優(yōu)點(diǎn)：Southern雜交準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)缺點(diǎn)：1、不經(jīng)過(guò)靶片段的擴(kuò)增(PCR)，一般每個(gè)電泳通道需要10~30μg的DNA，在實(shí)際操作中就需較大量的DNA樣品2、Soutllem雜交不能確定缺失的

18、準(zhǔn)確外顯子范圍，對(duì)檢測(cè)女性重復(fù)突變(duplication)或三重重復(fù)(triplication)攜帶者存在困難3、由于DMD基因很大，需要6到8個(gè)cDNA探針，雜交反應(yīng)才能覆蓋整個(gè)DMD基因，要1～2周時(shí)間用來(lái)分析，勞動(dòng)量大4、需要使用放射性同位素作為示蹤物，會(huì)對(duì)工作環(huán)境帶來(lái)污染,多重探針連接依賴性擴(kuò)增技術(shù) MLPA,multiplex probe ligation dependent amplification原理針對(duì)所有需

19、要檢測(cè)突變的DNA序列，設(shè)計(jì)多對(duì)特異探針固定在尼龍膜上和待測(cè)樣品DNA雜交然后洗膜（正常序列和探針雜交后不被洗脫）利用連接酶把探針連接起來(lái)使用一套通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用PCR儀進(jìn)行分析，DNA片段的缺失／重復(fù)以及拷貝數(shù)以測(cè)序儀得到信號(hào)的有無(wú)及信號(hào)的峰高或面積進(jìn)行計(jì)算,,優(yōu)點(diǎn)：可以在1個(gè)PCR管中完成多達(dá)40個(gè)外顯子的缺失／重復(fù)檢測(cè)專門(mén)用于DMD缺失／重復(fù)檢測(cè)的試劑盒，通過(guò)2個(gè)PCR反應(yīng)就可以完成79個(gè)外顯子及其

20、非翻譯序列的缺失／重復(fù)突變篩查靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)快捷,DMD患者(A)及其母親(B)的20-47號(hào)外顯子的MLPA檢測(cè)結(jié)果,,變性高效液相色譜 DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography原理用離子對(duì)逆向?qū)游龇ǚ蛛x并檢測(cè)異源雙鏈通過(guò)三乙基醋酸鈉（TEAA)作為橋分子，帶正電的氨基與核酸分子帶負(fù)電電荷的磷酸基相互作用，烷基端與色譜柱基質(zhì)表面的疏水基

21、團(tuán)相連不同大小的DNA片段所含的磷酸根數(shù)目不同，與固定相的結(jié)合力不同隨著流動(dòng)相中乙腈濃度(離子對(duì)／洗脫液的比值)的增加，DNA／TEAA與柱基質(zhì)的疏水作用力逐漸減弱，最終被洗脫下來(lái)檢測(cè)柱洗脫液在260 nm處的吸光度，樣品中各成分在色譜圖中顯示為不同的吸收峰優(yōu)點(diǎn): 靈敏度高、分析快捷以及可以進(jìn)行半自動(dòng)化分析,,,,Merci de votre attention !,參考文獻(xiàn),DMD／BMD基因診斷研究進(jìn)展，徐曉雪 張朝東 李嘉