9α-羥基雄甾-4-烯-3,17二酮的生物合成研究.pdf

1、甾體類藥物在臨床上應(yīng)用廣泛，是僅次于抗生素的第二大類藥物。目前甾體的合成主要采用化學(xué)半合成法和微生物法，微生物法常應(yīng)用于生產(chǎn)雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)、雄甾-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)、9α-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)等前體物質(zhì)。9α-OH-AD在臨床上常作為皮質(zhì)激素、抗雄性激素、抗雌性激素與避孕功能藥物使用，具有重要的商業(yè)價(jià)值。目前，應(yīng)用于生產(chǎn)9α-OH-AD的菌株多為分枝桿菌屬與紅球菌屬

2、，現(xiàn)有方法存在著環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)率低等問(wèn)題。大腸桿菌無(wú)論是在菌種安全性、菌體生長(zhǎng)速度、實(shí)驗(yàn)操作和工業(yè)生產(chǎn)上均有較大的優(yōu)勢(shì)，利用大腸桿菌構(gòu)建工程菌株進(jìn)行9α-OH-AD的制備已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本文以3-甾酮-9α-羥基化酶系統(tǒng)(KSH)為研究對(duì)象，以大腸桿菌為宿主菌，高效表達(dá)了3-甾酮-9α-羥基化酶(KshA)與3-甾酮-9α-羥基化酶還原酶(KshB)，通過(guò)共表達(dá)KshA、KshB、構(gòu)建KshA與P450 BM-3還原域的融合蛋

3、白，以檢測(cè)電子傳遞功能域?qū)shA活性的影響，最后又檢測(cè)了輔酶再生系統(tǒng)在催化體系中的作用。
　　1)高效表達(dá)了紅平紅球菌和分枝桿菌來(lái)源的KshA酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅平紅球菌的KshA酶對(duì)底物AD具有較好的催化活性，并基于大腸桿菌，以AD為底物，對(duì)制備9α-OH-AD的催化反應(yīng)進(jìn)行了探索。最終在底物濃度500μM的條件下，9α-OH-AD得率達(dá)到97.09％。
　　2)高效表達(dá)同樣來(lái)源于紅平紅球菌的KshB酶，并使用Ni柱親和層析的

4、方法將KshB酶純化出來(lái)，使用純化后的KshB酶進(jìn)行反應(yīng)證明，KshB是一種輔酶NADH依賴型的還原酶。
　　3)對(duì)表達(dá)KshA-P450融合蛋白和共表達(dá)了KshA、KshB酶的工程菌株分別進(jìn)行了制備9α-OH-AD的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，最終表達(dá)融合蛋白KshA-P450的菌株取得了較好的結(jié)果，反應(yīng)速度是單獨(dú)表達(dá)KshA菌株的2.18倍。
　　4)對(duì)課題組原有的fdh基因進(jìn)行了一個(gè)三位點(diǎn)同時(shí)突變實(shí)驗(yàn)，獲得基因fdh3m。并以此基因