CHD4蛋白與PTEN蛋白相互作用的鑒定.pdf

1、目的:分別在細(xì)胞水平和體外檢測(cè)PTEN與Mi-2β/CHD4之間的相互作用,進(jìn)一步明確其相互作用的結(jié)構(gòu)域。
　　研究方法:本課題擬在已有工作的基礎(chǔ)上,利用GSTpull-down、免疫共沉淀等方法,檢測(cè)PTEN與Mi-2β/CHD4之間的相互作用,通過(guò)構(gòu)建截短體,明確結(jié)合核心結(jié)構(gòu)域。采用PCR方法擴(kuò)增CHD4的染色質(zhì)調(diào)節(jié)區(qū)(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA結(jié)合區(qū)(CHD4-D)基因片段,將目的基因片段插入原核表

2、達(dá)載體pGEX-5T構(gòu)建GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒,陽(yáng)性克隆行DNA序列測(cè)定。IPTG誘導(dǎo)GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表達(dá),谷胱甘肽瓊脂糖珠純化融合蛋白,表達(dá)產(chǎn)物Westernblot進(jìn)行鑒定。用純化后GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白與PTEN-HIS進(jìn)行GSTpull-down檢測(cè)CHD4蛋白與PTEN蛋白在體外相互作用及作用結(jié)構(gòu)域。將HA-PCMV、HA-CH

3、D4真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)CHD4蛋白與PTEN蛋白在細(xì)胞水平的相互作用。
　　結(jié)果:成功純化了較高純度的GST、GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,并進(jìn)行GSTpull-down結(jié)果表明CHD4蛋白與PTEN蛋白在體外相互作用且作用在CHD4染色質(zhì)結(jié)合域端;免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)CHD4蛋白與PTEN蛋白在細(xì)胞水平存在相互作用,為進(jìn)一步研究CHD4蛋白在染色質(zhì)重塑中