NDRG2在心肌缺血再灌注損傷中Akt所介導(dǎo)的胰島素保護效應(yīng)中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(NDRG2),與其他NDRG2家族的蛋白存在約60％相似的氨基酸殘基。NDRG2與細胞生長,分化,應(yīng)激和激素的刺激反應(yīng)存在密切聯(lián)系.以往研究表明,NDRG2的表達可受到多種合成代謝和分解代謝激素調(diào)節(jié),比如地塞米松,雄激素 and醛固酮.盡管 NDRG2在心臟中高表達,但它在心血管系統(tǒng)中的功能還廣泛未知。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注(I/R)損傷可改變心肌組織中NDRG2的表達。

2、r>　　心血管事件例如急性心肌梗死是引起患者致殘和致死的主因。冠狀動脈發(fā)生梗塞后,臨床現(xiàn)有的挽救存活心肌的主要措施包括冠脈血運的重建,即再灌注。但是,缺血組織的血運重建本身可引發(fā)心肌的再灌注損傷,不僅可以造成細胞死亡,還可以引起心肌組織功能性的損傷,反而降低了血運重建所帶來的益處。因此,明確再灌注損傷的具體分子機制和尋找新的目標分子來緩解再灌注損傷已經(jīng)成為研究的熱點。
　　很多文獻對于胰島素在缺血再灌注損傷中所起的心肌保護特性已有

3、了較為詳盡的報道。胰島素可以通過激活一系列胞內(nèi)蛋白激酶來保護心肌抵御缺血再灌注損傷,這些激酶被命名為再灌注損傷補救激酶(reperfusion injury salvage kinases:RISK),包括PI3K-Akt, JAK-STAT和ERK系統(tǒng)的激活。但是,胰島素發(fā)揮心肌保護作用的機制還沒有被完全闡述清楚。NDRG2作為蛋白激酶Akt的底物之一,可以參與Akt介導(dǎo)的胰島素信號傳導(dǎo)通路。我們的前期研究表明,在Akt介導(dǎo)的胰島素保

4、護胰島β細胞抵抗游離脂肪酸引發(fā)的損傷中,NDRG2發(fā)揮了重要作用。但是,NDRG2是否有可能在胰島素心肌保護中發(fā)揮作用還未見文獻報道。
　　實驗?zāi)康模?br>　　在本研究中,我們首先觀察在心肌細胞和心肌組織在經(jīng)受缺血再灌注損傷過程中,NDRG2總蛋白和磷酸化蛋白水平的表達情況,以及其受到胰島素干預(yù)的調(diào)節(jié)情況和分子機制。在此基礎(chǔ)上,進一步探討在心肌缺血再灌注損傷過程中,NDRG2的磷酸化水平的變化是否參與了Akt所介導(dǎo)的胰島素的心肌

5、保護效應(yīng)。
　　材料和方法：
　　1.雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重在140-180g之間,建立大鼠心肌缺血再灌注模型。采用腹腔注射戊巴比妥鈉溶液的方法麻醉大鼠,以體外量循環(huán)呼吸機保證術(shù)中動物呼吸。在大鼠左側(cè)股動脈中置入一根預(yù)先充滿肝素化生理鹽水的PE-50導(dǎo)管來監(jiān)測術(shù)中大鼠血壓。大鼠心跳速率通過 ECG來測量。在大鼠的左胸部位作一切口,暴露心臟,以6-0的絲線圍繞冠狀動脈左前降支(LAD)做一活結(jié)。缺血

6、30分鐘后,解開線結(jié),恢復(fù)LAD血運。假手術(shù)組接受開胸等類似的的手術(shù)過程,除了阻斷LAD這一步驟。
　　2.在第一部分實驗中,為了觀察NDRG2的磷酸化水平在心肌組織中的變化情況,我們首先將大鼠隨機分成以下幾個組:假手術(shù)組,單純?nèi)毖M(30 min),缺血30min后分別加1,2,3 or4 h的再灌注(n=5).在第二部分實驗中,為了檢測胰島素對于Akt/NDRG2信號通路的效應(yīng),大鼠隨機分組并接受以下處理:(1)假手術(shù)組;(2

7、)安慰劑組(0.9%NaCl);(3)極化液GIK(葡萄糖:200 g/L,胰島素:60 U/L,鉀離子:60 mEq/L),從再灌注5min前開始靜脈輸注4h(4 mL/kg/h);(4)
　　去胰島素極化液 GK(葡萄糖+鉀離子)(n=16).術(shù)前用小動物超聲監(jiān)測大鼠心臟功能來建立基線標準。
　　3.乳鼠原代心肌細胞的培養(yǎng)和體外模擬缺血/再灌注(SI/R)模型的建立;大鼠H9C2心肌細胞系和INS-1胰島素瘤細胞系的培養(yǎng)

8、。
　　4. siRNA以及 lenti-shRNA的合成與轉(zhuǎn)染:siRNA的合成序列為:5'-CCAAACGUCCAGCGAUAUUCATT-3'。siRNAs以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。預(yù)實驗結(jié)果顯示,攜帶有GFP基因序列的對照慢病毒感染原代心肌細胞后,70–80%的細胞可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光信號。
　　5.在體動物水平的病毒接種:在手術(shù)4天前,雄性SD大鼠以戊巴比妥鈉麻醉后,經(jīng)口氣管插管后

9、,體外呼吸機建立正壓通氣。在左側(cè)胸部第四肋間作一切口暴露心臟。用微量注射器抽吸病毒后,分別分三個點注射到即將缺血心肌處。
　　6.伊文氏藍/TTC染色測定心肌梗死范圍;TUNEL染色,免疫印跡法和流式細胞法檢測心肌細胞凋亡;小動物心臟超聲檢測大鼠左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS);反轉(zhuǎn)錄PCR檢測各基因mRNA表達水平;免疫印跡法檢測各總蛋白和磷酸化蛋白水平。
　　實驗結(jié)果：
　　1.NDRG2的磷酸

10、化水平在再灌注早期(1h)有輕度上升的趨勢,但是其總蛋白水平無顯著差異。隨著時間的推移,NDRG2的磷酸化水平逐漸降低,并且在再灌注4h時達最低點。當(dāng)原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞在經(jīng)受體外模擬的缺血再灌注應(yīng)激下,我們也可以觀察到類似的趨勢,NDRG2的磷酸化水平大約在恢復(fù)氧供6h時達最低點。
　　2.再灌注時期輸注 GK液(去胰島素極化液)可以顯著提高大鼠血糖濃度,但是再灌注4h末,GIK極化液輸注組和溶劑對照組兩組血糖水平無顯著性差異

11、。與溶劑組相比,GIK治療組在再灌注4h末,血漿中胰島素水平得到了顯著提高。
　　3.相比較GK治療組和溶劑對照組,GIK治療組的caspase3的活性形式表達水平顯著降低。免疫組化結(jié)果顯示,GIK治療組損傷心肌局部的黃褐色蛋白顯著減少,表明了caspase3的活性形式表達水平的降低。此外,TUNEL染色也顯示相同的趨勢。
　　4.與GK治療組和溶劑對照組相比,在再灌注24h后,胰島素治療組(GIK)心肌梗死區(qū)(INF)占危

12、險區(qū)(AAR)百分比顯著減小。此外,小動物超聲檢測大鼠的心功能顯示胰島素的使用可顯著提高心臟左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVES),而其它兩組在治療后心功能相對于非治療對照組無顯著性差異。
　　5.在缺血30min再灌4h后,胰島素的使用可以顯著的逆轉(zhuǎn)在缺血再灌注NDRG2和Akt的下降趨勢,NDRG2的磷酸化位點為Thr348,Akt的磷酸化位點為Ser473.而NDRG2和Akt的總蛋白水平在給予胰島素干預(yù)后無顯

13、著變化。此外,當(dāng)給予原代心肌細胞模擬缺血再灌注損傷刺激后,胰島素的處理可以上調(diào) Akt在Ser473位點的磷酸化水平。胰島素的這一作用可被PI3K的抑制劑Wortmannin所阻斷。與此同時,胰島素也可以上調(diào)NDRG2在Thr348位點的磷酸化水平,這一作用同樣可以被Wortmannin以及Akt激酶特異性的抑制劑所阻斷。
　　6.相比較單用胰島素,當(dāng)胰島素同Wortmannin或Akt抑制劑共同處理原代心肌細胞時,caspase

14、3的活性形式的表達水平顯著提高。同時,胰島素同Wortmannin或Akt抑制劑共處理組的TUNEL陽性細胞也較單用胰島素組顯著增多。此外,我們還培養(yǎng)了大鼠胚胎來源的心肌細胞系H9C2細胞系并給予了相似的缺血再灌注處理。流式結(jié)果分析顯示,相較于單用胰島素組,胰島素同Wortmannin或Akt抑制劑共處理組凋亡的細胞數(shù)量顯著增多。
　　7.對照siRNA處理后,INS-1細胞NDRG2的表達無顯著變化。但是,NDRG2siRNA可

15、以對INS-1細胞中NDRG2的表達產(chǎn)生影響,且呈濃度梯度依賴性。基于此siRNA序列的NDRG2shRNA的慢病毒顆粒感染心肌細胞三天后,細胞NDRG2的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)。
　　8.盡管胰島素的處理誘導(dǎo)了Akt的激活,但是NDRG2的總蛋白水平核在Thr348位點的磷酸化水平均受到了抑制,NDRG2干涉后的心肌細胞呈現(xiàn)出更高的caspase3活性形式的表達。同時,在用對照病毒顆粒感染INS-1細胞后,胰島素處理可產(chǎn)生

16、明顯的保護作用。但是,在用攜帶特異性針對NDRG2的NDRG2shRNA病毒顆粒感染INS-1細胞后,即使用胰島素處理,TUNEL染色也顯示出顯著升高的凋亡細胞比例。
　　9.慢病毒顆粒局部注射24h后,免疫熒光染色結(jié)果顯示,對比非注射區(qū),注射區(qū)心肌局部CD11b呈陽性的細胞數(shù)量部分增多。在針對NDRG2的慢病毒顆粒注射9.慢病毒顆粒局部注射24h后,免疫熒光染色結(jié)果顯示,對比非注射區(qū),注射區(qū)心肌局部CD11b呈陽性的細胞數(shù)量部分

17、增多。在針對NDRG2的慢病毒顆粒注射96h后,NDRG2在注射區(qū)域局部心肌組織的mRNA和蛋白水平均顯著下降;而使用Scramble病毒后,相比對照組,注射區(qū)域NDRG2的蛋白水平無顯著差異。免疫組化染色結(jié)果也提示,注射區(qū)域,即在手術(shù)中將受到缺血的區(qū)域,NDRG2表達在三個不同的位點均得到顯著降低。但是,遠離注射區(qū)域,比如室間隔和右室,心肌的NDRG2水平無顯著下調(diào)。此外,慢病毒顆粒的注射沒有誘導(dǎo)遠離注射區(qū)域心肌NDRG2總蛋白和磷酸

18、化水平的變化。
　　10.當(dāng)以GIK極化液治療后,相比較Scramble病毒處理組,NDRG2干涉慢病毒處理組心肌組織的活性caspase3表達水平比Scramble病毒處理組心肌顯著提高;心肌組織中綠色TUNEL陽性細胞比例顯著提高。此外,EB/TTC染色顯示,相比較Scramble病毒處理組,NDRG2干涉慢病毒處理組大鼠心肌梗死區(qū)域占危險區(qū)百分比(INF/AAR)顯著提高。小動物心臟超聲結(jié)果也提示,NDRG2干涉慢病毒處理組

19、的大鼠左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)均較Scramble病毒處理組顯著降低。
　　11.給予NDRG2干涉慢病毒處理后,鄰近區(qū)域心肌的NDRG2水平相比較遠離區(qū)域無顯著降低。TUNEL染色也顯示,GIK治療后,NDRG2干涉慢病毒處理組和Scramble病毒處理組的鄰近區(qū)域的凋亡率無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　我們在這項研究中主要對在心肌缺血再灌注損傷損傷,NDRG2的磷酸化形式在胰島素發(fā)揮心肌保

20、護效應(yīng)過程中所扮演的角色進行了探討,主要發(fā)現(xiàn)包括以下幾點:第一,在心肌缺血再灌注過程中,NDRG2磷酸化水平呈下降趨勢,有可能與Akt的磷酸化水平的變化相關(guān)。第二:再灌過程中的胰島素治療可以依賴PI3K/Akt途徑顯著提高NDRG2的磷酸化水平。第三,即使在有胰島素處理情況下,NDRG2的干預(yù)可加劇體外培養(yǎng)的原代心肌細胞的凋亡。第四也是最重要的一點,在動物水平的實驗中,人為的下調(diào)NDRG2的表達可顯著減弱胰島素治療所帶來的心肌保護作用。