超長鏈多不飽和脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因的密碼子優(yōu)化及油脂合成相關(guān)基因的克隆.pdf

1、超長鏈多不飽和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids，VLCPUFAs)，通常指含有18個碳原子以上并且?guī)в?個或2個以上的順式不飽和雙鍵的脂肪酸，比如花生四烯酸(AA，20:4△5，8，11，14)、二十碳五烯酸(EPA，20:5△5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6△4，7，10,13，16，19)。其中，EPA和DHA是魚油的主要有效成分，對人體營養(yǎng)和

2、健康具有重要的意義。目前，該類脂肪酸的主要來源是深海魚油。但是隨著環(huán)境污染的日益加劇以及過度捕撈造成的野生海洋魚類資源的急劇減少，魚油的產(chǎn)量和質(zhì)量都已經(jīng)不能夠滿足人們的要求。因此，尋找一條安全、穩(wěn)定、可持續(xù)的EPA/DHA替代生產(chǎn)途徑已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。眾多研究表明，利用基因工程的方法，在高等植物(特別是油料作物)中重組EPA/DHA的合成途徑進行魚油的替代生產(chǎn)是可行的，并且取得了一定的進展，但是EPA尤其是DHA的產(chǎn)量仍然不高，經(jīng)過分析

3、推測，造成EPA/DHA產(chǎn)量不高的原因可能是目標(biāo)植物的選擇、特異性啟動子的選擇、酶基因的活性高低、代謝途徑的選擇、異源表達時密碼子的偏好性以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。
　　 本研究從異源表達時密碼子的偏好性方面展開研究，對EPA/DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶基因進行多種方式的密碼子優(yōu)化，通過對優(yōu)化后酶基因的表達活性進行分析，探索出一條密碼子優(yōu)化提高基因表達活性的最佳方案。為在植物中高效生產(chǎn)EPA/DHA奠定基礎(chǔ)。
　　 同時，我們

4、從高產(chǎn)EPA/DHA的強壯前溝藻(Amphidinium carterae)中對油脂合成的關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸脫氫酶(GPDH)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因進行了克隆，為改良油料作物的油脂產(chǎn)量提供基因資源。主要結(jié)果如下：
　　 (1)球等鞭金藻(Isochrysis galbana)中△9鏈延長酶基因的密碼子優(yōu)化
　　 △9鏈延長酶是“△8去飽和途徑”中的關(guān)鍵酶，對于整個合成途徑具有重要意義，根據(jù)本實驗室已有的

5、研究，結(jié)合對來源于球等鞭金藻的△9鏈延長酶基因在擬南芥中表達時密碼子使用情況的分析，我們采取了兩種策略對△9鏈延長酶基因進行密碼子優(yōu)化：第一種策略是針對偏好性最強的密碼子進行優(yōu)化，對△9鏈延長酶基因中的3個編碼精氨酸的CGC密碼子(使用頻率只有20％)以不同的方式進行優(yōu)化(單個CGC密碼子的優(yōu)化、多個CGC密碼子的優(yōu)化以及3個CGC密碼子的全部優(yōu)化)，優(yōu)化成在擬南芥中高效表達的AGA密碼子，編碼氨基酸不變；第二種策略是根據(jù)N端稀有密碼子

6、的存在會導(dǎo)致基因表達降低的研究結(jié)果，將△9鏈延長酶基因的N端16個密碼子全部優(yōu)化成在擬南芥中高效表達的密碼子，編碼氨基酸不變。轉(zhuǎn)擬南芥進行基因表達活性分析，以未優(yōu)化的△9鏈延長酶基因作為對照，與對照相比，單個CGC密碼子優(yōu)化與多個CGC密碼子優(yōu)化的△9鏈延長酶的表達活性變化不大，而3個CGC密碼子全優(yōu)化與N端16個密碼子全優(yōu)化的△9鏈延長酶活性提高較明顯，且N端16個密碼子全優(yōu)化方案略優(yōu)于3個CGC全優(yōu)化方案。
　　 (2)馬鈴

7、薯致病疫霉(Phytophthora infestans)中△6去飽和酶基因的密碼子優(yōu)化
　　 為了驗證△9鏈延長酶優(yōu)化結(jié)果的普遍性，我們又對△6去飽和酶進行優(yōu)化，并且在釀酒酵母中進行鑒定。△6去飽和酶是“△6去飽和途徑”中的關(guān)鍵酶，本實驗室已經(jīng)從馬鈴薯致病疫霉中成功克隆到了VLCPUFAs合成途徑中的多個酶基因并在釀酒酵母中進行了功能鑒定，其中△6去飽和酶的活性很低，還不到10％。通過比較△6去飽和酶基因在馬鈴薯致病疫霉與釀酒

8、酵母中表達時密碼子的使用頻率，并在對優(yōu)化的△9鏈延長酶的研究基礎(chǔ)上，我們采取了兩種策略優(yōu)化△6去飽和酶基因：第一種策略是針對偏好性最強的密碼子進行優(yōu)化，將△6去飽和酶基因的4個CGC密碼子(使用頻率僅13％)全部優(yōu)化成釀酒酵母中高效表達的AGA密碼子，編碼氨基酸不變；第二種策略是將N端16個密碼子全部優(yōu)化成釀酒酵母中高效表達的密碼子，編碼氨基酸不變。轉(zhuǎn)釀酒酵母進行表達活性分析，以未優(yōu)化的△6去飽和酶基因作對照，與對照相比，4個CGC密碼

9、子全部優(yōu)化和N端16個密碼子全部優(yōu)化的△6去飽和酶的活性都大大提高，無論是ω3轉(zhuǎn)化率還是ω6轉(zhuǎn)化率，都提高了30％之多，而且N端16個密碼子全優(yōu)化略優(yōu)于4個CGC密碼子全優(yōu)化的方案。這與△9鏈延長酶優(yōu)化結(jié)果一致。
　　 (3)強壯前溝藻(Amphidinium carterae)中油脂合成關(guān)鍵酶基因的克隆
　　 我們對富含DHA的強壯前溝藻的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，經(jīng)過生物信息學(xué)分析得到了許多油脂合成關(guān)鍵酶基因的部分序列。以強