溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶的鑒定及其對轉(zhuǎn)基因合成長鏈多不飽和脂肪酸的影響研究.pdf

1、長鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFAs）對人體有良好生理功能，除了魚油這種傳統(tǒng)來源外，在油料作物中重構LC-PUFAs的合成途徑是一種非常有前景的替代來源。在以表達脂連接型去飽和酶為策略的LC-PUFAs代謝工程研究中，去飽和酶中間代謝產(chǎn)物需要在PC庫和CoA庫之間進行多次轉(zhuǎn)換，導致LC-PUFAs合成的終產(chǎn)物含量較低。
　　LPCAT（屬于溶血磷脂?；D(zhuǎn)

2、移酶）被推測是在轉(zhuǎn)換過程中起重要作用的?；D(zhuǎn)移酶。然而，植物來源的LPCAT報道較少，而且LPCAT對LC-PUFAs合成的影響以及參與PC和CoA庫之間脂肪酰基轉(zhuǎn)運的機制尚不清楚。
　　本研究從煙草Nicotiana benthamiana和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中克隆LPCAT基因，并在酵母中進行功能驗證和底物特異性研究。通過將LPCAT與不同類型脂肪酸去飽和酶和延長酶在酵母中共表達，分析

3、其脂肪酸，CoA及脂質(zhì)組變化，試圖闡明LPCAT對LC-PUFAs合成的中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運及終產(chǎn)物積累的影響機制。主要結果如下：
　　（1）從煙草中克隆到兩個溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶基因NbLPCAT1和NbLCPAT2，其編碼產(chǎn)物均屬于MBOAT蛋白家族。LysoPAF敏感實驗表明NbLPCAT1和NbLCPAT2都有LPCAT?；D(zhuǎn)移酶活性。酵母磷脂分析實驗表明：表達NbLPCAT1和NbLPCAT2的重組酵母優(yōu)先利用16:0-LPC

4、，16:1-LPC和18:1-LPC作為?；荏w；18:2-CoA，18:3-CoA為?；w。
　　利用重組酵母微粒體為LPCAT酶源的體外酶活實驗表明：NbLPCAT1對LPC及不飽和的C18-CoAs表現(xiàn)出偏好性。NbLPCAT2對LPA表現(xiàn)出的活性比LPC要高，且對18:3-CoA有較好的偏好性。采用RT-PCR方法檢測煙草LPCAT基因的表達模式，結果表明：NbLPCAT1和NbLPCAT2在花中的表達水平最高，在其它組

5、織器官中均有不同程度的表達。
　?。?）從富含EPA的三角褐指藻中克隆到一個PtLPCAT基因并驗證功能。將NbLPCAT1,NbLPCAT2及PtLPCAT與不同來源的脂肪酸去飽和酶和延長酶在酵母中共表達，這些脂肪酸去飽和酶和延長酶包括：來源于三角褐指藻的脂連接型去飽和酶PtD6，PtD5；來源于小立碗蘚的脂肪酸延長酶PSE；來源于青綠藻的CoA型去飽和酶OtD6和細小微胞藻中的CoA型去飽和酶MsD5。
　　構建三種不同

6、類型重組酵母并進行功能驗證，三種類型的重組酵母中分別共表達：(a)CoA型去飽和酶和延長酶；(b)脂連接型去飽和酶和延長酶；(c)脂連接型去飽和酶、延長酶和LPCAT。結果表明：(a)類型重組酵母中LC-PUFAs終產(chǎn)物的含量最高，(c)類型重組酵母與(b)類型重組酵母相比，△6去飽和酶中間代謝產(chǎn)物在CoA庫中的含量較高，終產(chǎn)物LC-PUFAs的積累量較高，表明LPCAT的表達促進了代謝中間產(chǎn)物的脂肪酰基在PC和CoA之間的轉(zhuǎn)移，在一定

7、程度上解除脂連接型去飽和酶應用于轉(zhuǎn)基因合成LC-PUFAs過程中的代謝瓶頸，提高LC-PUFAs的積累量。
　　（3）不同類型重組酵母脂質(zhì)組分析表明：(c)類型重組酵母與(b)類型重組酵母相比，表達NbLPCAT1的重組酵母菌株中PCsn-1、sn-2位置上18:2和18:3脂?；暮棵黠@上調(diào)，表達NbLPCAT2的重組酵母菌株中PCsn-1位置18:2脂?；可险{(diào)。
　　表明LPCAT的表達能夠明顯提高△6去飽和酶反應