Exendin-4對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(HRPE)的氧化應(yīng)激水平以及PEDF、VEGF分泌的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由各種代謝紊亂的引起的綜合征,認(rèn)為是遺產(chǎn)原因和環(huán)境原因的彼此作用而引起的。迄今為止,我們認(rèn)為,糖尿病的慢性并發(fā)癥可由多種因素引起,但是常被人們所接收的4條途徑為:即氨基己糖途徑、多元醇通路激活、晚期的糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products,AGEs)增加、蛋白激酶C的(protein kinase C,PKC)激活,這些途徑的本質(zhì)都是高糖引起

2、的氧化應(yīng)激的產(chǎn)物過(guò)分表達(dá)的成果,故糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素是氧化應(yīng)激。處于高糖應(yīng)激狀態(tài)下的機(jī)體,清除氧自由基的能力下降,氧自由基堆積,氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)的失衡,損傷了組織和細(xì)胞。視網(wǎng)膜富含多不飽和脂肪酸,具有高度攝取氧和氧化葡萄糖的能力,而RPE細(xì)胞處于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層與光感受器細(xì)胞層之間的高氧環(huán)境,對(duì)于缺氧及氧化應(yīng)激更為敏感。DM引起的糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是目前為止致盲率極

3、高的,最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥。多種病理機(jī)制參與 DR的形成。DR的新生血管及其纖維蛋白的生成、血-視網(wǎng)膜屏障破壞是其基本病理變化。新生血管的產(chǎn)生是臨床治療該病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),疾病的后面階段所引起玻璃體內(nèi)積血和由于粘連而拉扯而發(fā)生的視網(wǎng)膜剝離,嚴(yán)重影響視力,疾病發(fā)展嚴(yán)重時(shí),可導(dǎo)致失明。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial gro

4、wth factor,VEGF)分別作為主要的血管抑制因子與血管刺激因子,這兩者之間的平衡性調(diào)節(jié)對(duì)于新生血管的生成是相當(dāng)重要的。有研究表示,升高的血糖可以打破視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞中的VEGF和PEDF之間的動(dòng)態(tài)平衡,使VEGF異常增多,從而引起RPE細(xì)胞的病理性增生。DR的發(fā)生發(fā)展需要多個(gè)因素的參與,DR的重要的病理環(huán)節(jié)即血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞及視網(wǎng)膜病理性血管生成,認(rèn)為高糖

5、打破的VEGF和PEDF之間的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)誘導(dǎo)前兩個(gè)重要的病理環(huán)節(jié)的直接誘導(dǎo)因素。Dong等專家認(rèn)為VEGF過(guò)度分泌被過(guò)度的氧化反應(yīng)所刺激,從而引起了視網(wǎng)膜的病理性血管的生成,因此,故在DM引起的DR中抗氧化劑,是具有臨床意義的。研究證明了胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)及其相類似物能夠抵抗氧化應(yīng)激過(guò)分反應(yīng)、改善動(dòng)脈粥樣硬化,改善血管內(nèi)皮的功能,具有降低心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的潛在益處,這些研究提示

6、胰高血糖素樣肽-1保護(hù)RPE的作用可能與抗氧化抗炎作用有關(guān)。Exendin-4(E4)是一種毒蜥蜴的唾液中分離出的一種天然GLP-1類似物,與哺乳動(dòng)物的GLP-1具有較高的同源性。E4具有促進(jìn)胰腺胰島素的生成、增加其敏感度、改善胰島細(xì)胞的正常生理作用,且不被二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)分解,血漿半衰期較長(zhǎng),故此藥物運(yùn)用在臨床對(duì)糖尿病治療,是具有穩(wěn)定性和長(zhǎng)效性的。故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度的E4

7、作用于在高糖環(huán)境下,體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigment epithelial,HRPE)細(xì)胞株ARPE-1948h,并且觀察細(xì)胞的活力、細(xì)胞的形態(tài)、氧化應(yīng)激指標(biāo)及其PEDF、VEGF分泌的影響。
  方法:ARPE-19細(xì)胞株,在人體外培養(yǎng)48h,并隨機(jī)的分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組:(1)、正常參照組(葡萄糖濃度為:5mmol/l);(2)、高糖組(葡萄糖濃度為:25mmol/L);(3)、高糖+E4(

8、12nmol/L)組;(4)、高糖+E4(60nmol/L)組;(5)、高糖+E4(120nmol/L)組。各組細(xì)胞在C O2水平(5%)、溫度(37℃)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,應(yīng)用上述不同條件的培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,選取處于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞來(lái)做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。觀察HRPE細(xì)胞活力和形態(tài),比色法檢測(cè)總超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、和丙二醛(

9、malondialdehyde,MDA)的變化,HRPE細(xì)胞的上清液中PEDF與VEGF的含量用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法來(lái)測(cè)定,研究在高糖環(huán)境下,Ex-4對(duì)HRPE細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,從而更進(jìn)一步研究此藥物對(duì)治療DR的作用機(jī)制。
  結(jié)果:
  1.對(duì)比正常參照組,高糖組的GSH含量、總-SOD的活性顯著下滑,然而MDA的含量顯著提高(P<0.05);E4(12,60,120nmol/L)作用后,與高糖組對(duì)比,各給

10、藥組GSH含量及總-SOD活性都有相應(yīng)的提高,而MDA含量均下滑(P<0.05),并且有濃度依賴性。
  2.對(duì)比正常參照組,高糖組PEDF分泌含量顯著下滑,VEGF分泌含量顯著提高(P<0.05);E4(12,60,120nmol/L)作用后,與高糖組對(duì)比,各給藥組的PEDF的分泌量提高,同時(shí)降低VEGF的分泌量,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),并且有濃度依賴性。
  結(jié)論:
  1.在高糖環(huán)境的作用下,將增強(qiáng) HR

11、PE氧化應(yīng)激的水平,同時(shí)使血管刺激因子與血管抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡,造成PEDF分泌量的下滑,然后VEGF分泌量的增多,我們認(rèn)為,這很大程度上是與DR的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。
  2.一定濃度的E4Ex-4可降低在高糖環(huán)境下作用的HRPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo),PEDF分泌增多和VEGF分泌減少。這就提示了E4可能的作用機(jī)制,即通過(guò)對(duì)氧化作用和抗氧化作用之間的調(diào)節(jié),進(jìn)而調(diào)節(jié)PEDF和VEGF的平衡,從而使HRPE細(xì)胞得以保護(hù),抑制了DR病

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