雌激素對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用.pdf

1、目的： 探討雌激素對(duì)藍(lán)光及過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞內(nèi)活性氧生成以及細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，并觀察雌激素對(duì)氧化誘導(dǎo)的Akt活化及其下游效應(yīng)蛋白Bad磷酸化的影響，以探討Akt/Bad通路在雌激素抗氧化機(jī)制中發(fā)揮的作用。 方法： (1)對(duì)離體培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞接種于12孔板后分為對(duì)照組、E2組和ICI+E2組：對(duì)照組無(wú)藥物處理、E2組予10nM、100nM、1μM E2預(yù)處理

2、2h、ICI+E2組予雌激素受體拮抗劑ICI1827801μM聯(lián)合10nM E2共同處理2h，以藍(lán)光照射(2000±500Lx，470±20nm)或過(guò)氧化氫(H2O2，200uM)作氧化處理，在氧化處理前(0時(shí)相)以及氧化處理后30min、1h、2h、4h以2'7'-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度； (2)ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板或6孔板，分為空白對(duì)照組(氧化-，藥物-)、陰性對(duì)照組(氧化+

3、，藥物-)、E2組和ICI+E2組。E2組予10nM、100nM、1μM E2預(yù)處理2h，ICI+E2組予1μM ICI182780聯(lián)合10nM、100nM、1μME2共同預(yù)處理2h，以藍(lán)光照射(2000±500Lx，470±20nm)或H2O2，400uM作氧化處理12h。以MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性變化、以Hoechst染色以及Annexin V FITC-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡； (3)ARPE-19細(xì)胞接種于6孔

4、板，以Western Blot免疫印跡法檢測(cè)：1)10nM E2處理后0、30min、1h、3h、6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)的P-Akt表達(dá)；2)比較10nME2、1μM ICI182780+10nM E2處理后0、1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)的P-Akt表達(dá)；3)比較對(duì)照組和E2組(10nM E2預(yù)處理24h)在接受藍(lán)光照射(2000±500Lx，470±20nm)或200uM H2O2處理后0、30min、1h、2h時(shí)間點(diǎn)的P-Akt、P

5、-Bad表達(dá)；4)比較對(duì)照組、E2組(10nM E2預(yù)處理24h)、ICI+E2組(1μM ICI182780+10nM E2預(yù)處理24h)在0時(shí)相、藍(lán)光照射(2000±500Lx，470±20nm)后1 h、H2O2(200μM)處理后30min的P-Akt表達(dá)。 結(jié)果： (1)藍(lán)光照射和過(guò)氧化氫均可顯著增強(qiáng)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光，提示藍(lán)光照射和過(guò)氧化氫處理均成功誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，10nM、100nM、1uM17

6、β-雌二醇劑量依賴性地減低藍(lán)光照射和過(guò)氧化氫處理后ARPE-19細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光增強(qiáng)的幅度，1μICI182780能阻斷10nM E2對(duì)藍(lán)光照射誘導(dǎo)ROS生成的抑制作用，但不能阻斷10nME2對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)ROS生成的抑制作用； (2)10nM、100nM、1uM17β-雌二醇可減弱以藍(lán)光照射和H2O2處理建立的實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激模型對(duì)ARPE-19活性的影響，降低細(xì)胞的凋亡率和死亡率。10nM17β-雌二醇這一保護(hù)作用可被1μMI

7、CI182780阻斷； (3)10nM17β-雌二醇能誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞一過(guò)性的p-Akt表達(dá)；10nM17β-雌二醇預(yù)處理24小時(shí)能使藍(lán)光照射和H2O2處理誘導(dǎo)的P-Akt、P-Bad表達(dá)顯著增強(qiáng)。1uM ICI182780可阻斷10nM17β-雌二醇誘導(dǎo)的一過(guò)性P-Akt表達(dá)以及對(duì)藍(lán)光照射和H2O2處理誘導(dǎo)的P-Akt表達(dá)的增強(qiáng)作用。 結(jié)論： 雌激素17β-雌二醇能通過(guò)依賴或非依賴雌激素受體的方式減少藍(lán)光