注射型豬小腸黏膜下層復合脂肪間充質干細胞治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的實驗研究.pdf

1、第一部分、大鼠ADSCs體外分離培養(yǎng)及CM-DiI標記后的傳代示蹤
　　目的：通過體外實驗建立一種分離培養(yǎng)大鼠脂肪間充質干細胞（Adipose-derived stem cells；ADSCs）并將其用CM-DiI標記的方法，探討CM-DiI標記后的細胞用于傳代示蹤的可行性。
　　方法：在無菌條件下剝離出大鼠腹股溝處的脂肪組織（去除血管和筋膜）并將其剪碎，Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織，提取出原代細胞，并進行消化傳代培養(yǎng)。對各代細胞

2、形態(tài)進行觀察，將第3代細胞用流式細胞儀進行間充質干細胞表面標志物的鑒定，并將其進行成脂成骨分化誘導，以確定培養(yǎng)出的細胞為ADSCs。用CM-DiI標記第3代ADSCs，熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察此代細胞的熒光標記情況，并用流式細胞儀測定此代細胞的標記率。將標記后的ADSCs繼續(xù)培養(yǎng)并進行消化傳代，在傳代至第6代和第9代時，用流式細胞儀分別測定這兩代ADSCs的標記率。
　　結果：在體外成功提取出ADSCs，其呈現(xiàn)長梭形、

3、魚群樣、旋渦狀樣的生長。傳代后的細胞逐漸純化，并且生長增殖速度加快，細胞形態(tài)無明顯變化。第3代ADSCs的表面重要標志物CD29和CD90均陽性表達（表達率分別為95.04％、99.65%），而造血細胞表面標志物CD34、CD45和CD31均陰性表達（表達率分別為0.17%、0.20%、0.14%）。ADSCs能進行成脂成骨的誘導分化。CM-DiI能成功標記ADSCs，標記后的細胞呈現(xiàn)紅色熒光，隨著代數(shù)的增加，熒光強度逐漸減弱，至第9代

4、仍未消失。流式細胞儀測定傳代后的ADSCs的CM-DiI標記率，第3代時標記率為97.09%，第6代時標記率為66.21%，而第9代時標記率仍有37.86%。
　　結論：大鼠ADSCs具有很強的生長增殖能力，其能陽性表達間充質干細胞的表面重要標志物，且具有成脂成骨的分化潛能。CM-DiI標記ADSCs方便易行，標記率高，示蹤效果良好，顯示其可成為細胞標記示蹤的良好熒光染料，能為后續(xù)進一步的體內實驗奠定基礎。
　　第二部分、注

5、射型SIS與ADSCs的體外共培養(yǎng)
　　目的：制備可注射型的豬小腸黏膜下層（Small intestinal submucosa；SIS），并探討其作為注射型生物支架材料與大鼠脂肪間充質干細胞(ADSCs)的體外共培養(yǎng)情況。
　　方法：將培養(yǎng)出的ADSCs用流式細胞儀進行間充質干細胞表面標志物的鑒定和成脂成骨的分化誘導，并將其進行CM-DiI熒光標記。制備可注射型的SIS并將其與ADSCs復合培養(yǎng)，HE染色觀察注射型SIS的

6、脫細胞情況，掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察注射型SIS及其與細胞復合后的情況。制備100%、75%、50%和25%濃度的注射型SIS材料浸提液，將ADSCs分別在各濃度的材料浸提液下培養(yǎng)，CCK-8試劑盒檢測ADSCs在第1、3、5、7天的增殖情況和材料的毒性。Live/dead染色試劑盒檢測ADSCs在100%濃度的材料浸提液中第1、3、5、7天的存活情況。
　　結果：分離培養(yǎng)出的ADSCs能陽性表達間充質干細胞表面重要標志物且具有成

7、脂成骨的分化能力。HE染色顯示注射型SIS上無殘留細胞。掃描電鏡觀察到注射型SIS有較多大小不一的三維孔隙，ADSCs能在材料上很好的黏附，呈橢圓形和條索狀生長。CCK-8檢測顯示與材料共培養(yǎng)的ADSCs增殖率提高且材料無細胞毒性。Live/dead染色試劑盒檢測顯示ADSCs在100%材料浸提液中存活良好，并且與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)第1、3、5、7天的死細胞比例沒有差別。
　　結論：注射型SIS有良好的三維結構，無細胞毒性，與AD

8、SCs復合具有良好的生物相容性，其促進ADSCs的生長與增殖，顯示其可作為脂肪組織工程一種注射型的天然生物支架材料，為呈遞細胞提供一種新的形式。
　　第三部分、注射型SIS復合ADSCs治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的實驗研究
　　目的：再生醫(yī)學為燒傷創(chuàng)面提供了多種治療方式，尋找良好的皮膚替代物治療燒傷創(chuàng)面成為一大趨勢。為此，本文擬探討注射型SIS與大鼠ADSCs二者混合物注射治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的可行性。
　　方法：將64

9、只大鼠隨機分為A組（空白對照組）、B組（ADSCs組）、C組（注射型SIS組）、D組（注射型SIS﹢ADSCs組），每組16只大鼠，均用100℃沸水作用于大鼠背部皮膚10秒以造模。燙傷后即對創(chuàng)面邊緣和中心區(qū)域進行注射治療，A、B、C、D四組分別注射1ml PBS液，1ml含有2×107ADSCs的PBS液，1ml質量分數(shù)為20%的注射型SIS，1ml2×107ADSCs和質量分數(shù)為20%的注射型SIS的二者混合物，用凡士林紗布和無菌紗布

10、依次覆蓋創(chuàng)面，透氣膠帶環(huán)繞包扎大鼠軀干。在二者混合物注射治療后的第3、7、14、21天采用大體觀察、創(chuàng)面微血管密度、組織病理學及組織學免疫熒光的方法來評價二者混合物注射治療對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的修復情況。
　　結果：二者混合物注射治療后的第3天，A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為7.75±1.30%，13.90±1.01%，14.7±1.10%，19.14±1.56%；第7天，四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為21.45±1.19%，4

11、1.34±5.80%，40.62±4.93%，58.28±2.62%；第14天，四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為50.91±1.28%，67.15±0.86%，69.54±0.81%，85.31±1.05%；第21天，四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為62.68±3.14%，82.19±1.61%，88.77±0.73%，100±0%。D組創(chuàng)面閉合率較 A、B、C三組均高（P＜0.01）。二者混合物注射治療后的第7天，A、B、C、D四組創(chuàng)面微血管密度分別

12、為（11.5±4.6，24.6±6.3，20.1±9.7，39.2±7.3）個/cm2，D組微血管密度均大于A、B、C三組（P＜0.05）。HE染色顯示D組新生血管較另外三組多，而炎癥細胞浸潤最少。呈現(xiàn)綠色熒光的CD31部分能與呈現(xiàn)紅色熒光的ADSCs在同一創(chuàng)面區(qū)域共存，顯示出橢圓狀的新生血管結構。二者混合物注射治療后的第21天，B、C、D三組創(chuàng)面均有新生表皮生成，且D組新生表皮最厚，而A組未見明顯新生表皮生成。呈現(xiàn)綠色熒光的CK10部