GA6通過調(diào)節(jié)自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究.pdf

1、目的:自噬是細(xì)胞在有害刺激如饑餓、低氧、生長因子缺乏等條件下利用溶酶體降解大分子物質(zhì)以及自身受損的細(xì)胞器的一個過程，在生物細(xì)胞內(nèi)多數(shù)的長半衰期蛋白質(zhì)都可以通過自噬這一途徑來進(jìn)行降解，進(jìn)而達(dá)到維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。眾所周之，自噬是真核生物在進(jìn)化過程中高度保守的分解代謝方式，它和凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種形式，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，而我們研究的GA是一個較新的基因，對于其在腫瘤中的作用研究才剛剛起步，也很局限，本課題以GA6為基

2、礎(chǔ)，針對主要參與自噬的基因進(jìn)行研究，旨在通過探索GA6調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，為今后以GA6為靶標(biāo)的臨床藥物應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:利用生長曲線、克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證GA6對腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移情況的影響。采用PCR技術(shù)從人的乳腺文庫中擴(kuò)增出我們所需的目的基因片段，將這些序列插入到pGEX—KG、pET-28a、GST等載體中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒:western blot驗(yàn)證過表達(dá)和敲低GA6對自噬的影響。體外給予

3、自噬誘導(dǎo)條件，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察GA6與LC3B的共定位情況。免疫共沉淀驗(yàn)證GA6與自噬相關(guān)基因是否有相互作用:GST pull-down技術(shù)及蛋白體外作用技術(shù)驗(yàn)證GA6對Atg4B和LC3B作用的影響。
　　結(jié)果:GA6能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和遷移;GA6與LC3B存在共定位，且是自噬發(fā)生發(fā)展過程中所必須的:GA6與Atg4B、LC3B存在間接和直接的相互作用，且與LC3B的作用強(qiáng)于與Atg4B的相互作用:GA6與P62、