GA6通過調節(jié)自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制研究.pdf

1、目的:自噬是細胞在有害刺激如饑餓、低氧、生長因子缺乏等條件下利用溶酶體降解大分子物質以及自身受損的細胞器的一個過程，在生物細胞內多數(shù)的長半衰期蛋白質都可以通過自噬這一途徑來進行降解，進而達到維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。眾所周之，自噬是真核生物在進化過程中高度保守的分解代謝方式，它和凋亡是細胞程序性死亡的兩種形式，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，而我們研究的GA是一個較新的基因，對于其在腫瘤中的作用研究才剛剛起步，也很局限，本課題以GA6為基

2、礎，針對主要參與自噬的基因進行研究，旨在通過探索GA6調控腫瘤細胞自噬的分子機制，為今后以GA6為靶標的臨床藥物應用提供理論依據(jù)。
　　方法:利用生長曲線、克隆形成、劃痕實驗來驗證GA6對腫瘤細胞的生長、增殖、遷移情況的影響。采用PCR技術從人的乳腺文庫中擴增出我們所需的目的基因片段，將這些序列插入到pGEX—KG、pET-28a、GST等載體中，構建出重組質粒:western blot驗證過表達和敲低GA6對自噬的影響。體外給予

3、自噬誘導條件，通過免疫熒光實驗觀察GA6與LC3B的共定位情況。免疫共沉淀驗證GA6與自噬相關基因是否有相互作用:GST pull-down技術及蛋白體外作用技術驗證GA6對Atg4B和LC3B作用的影響。
　　結果:GA6能促進腫瘤細胞的生長、增殖和遷移;GA6與LC3B存在共定位，且是自噬發(fā)生發(fā)展過程中所必須的:GA6與Atg4B、LC3B存在間接和直接的相互作用，且與LC3B的作用強于與Atg4B的相互作用:GA6與P62、