布拉氏酵母菌對NAFLD小鼠肝臟Egr-1表達(dá)及腸黏膜機(jī)械屏障作用的初步研究.pdf

1、目的：西方飲食建立非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）小鼠模型，觀察血清內(nèi)毒素水平，肝臟早期生長反應(yīng)因子-1（early growth response-1, Egr-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）表達(dá)及腸黏膜機(jī)械屏障變化情況，進(jìn)而探討布拉氏酵母菌干預(yù)后的影響，初步探討該藥物對NAFLD的療效以及相關(guān)作用機(jī)制。

2、>　　方法：
　　將30只6-8周齡的清潔級雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)分為正常對照組（CG，n=12）和模型組（MG，n=18）。正常對照組給予正常對照飲食（AIN93M對照飼料+正常飲用水）喂養(yǎng)，模型組給予西方飲食(高脂飼料+高糖飲用水)喂養(yǎng)。于喂養(yǎng)的24周末隨機(jī)處死各組6只小鼠，留取相應(yīng)標(biāo)本，并進(jìn)行肝臟HE染色，病理改變證實(shí)NAFLD小鼠模型成功。自第25周起，將模型組剩余12只小鼠隨機(jī)分為布

3、拉氏酵母菌灌胃組（TB，n=6）和模型灌胃對照組（TD，n=6），繼續(xù)西方飲食喂養(yǎng)。正常對照組剩余6只小鼠為正常灌胃對照組（NG，n=6），繼續(xù)給予正常對照飲食。TB組給予布拉氏酵母菌（5.98×108 CFU/kg/day）灌胃， TD組及NG組同時開始給予布拉氏酵母菌相應(yīng)輔料果糖（284mg/kg/day）+乳糖（19mg/kg/day）溶于蒸餾水中灌胃，每日灌胃1次，共6周，6周后處死全部小鼠，留取標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)檢測。
　　觀

4、察小鼠的毛色、行為、精神狀態(tài)等情況，同時每周測定小鼠體重。處死小鼠后，觀察肝臟及回腸的大體情況，并完整切除肝臟，留取末端回腸組織，稱肝臟濕重；采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、甘油三酯（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC）水平

5、；采用鱟試劑法測定血清脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）水平；HE染色觀察肝臟及末端回腸黏膜病理變化；透射電鏡觀察回腸組織超微結(jié)構(gòu)的改變；采用Real-time Q-PCR（Real-time quantitation PCR）方法檢測各組小鼠肝臟Egr-1、TNF-α及末端回腸組織中TNF-α、Occludin mRNA的表達(dá)情況；蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肝臟Egr-1、TNF-α及末端回腸

6、組織中Occludin、TNF-α的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗動物的一般情況
　　正常對照組小鼠皮毛順滑、濃密、有光澤，精神狀態(tài)良好，活動靈活，反應(yīng)靈敏，體重逐漸增加；模型組小鼠自造模第4周開始皮毛欠光滑，稍顯油膩，精神差，體重增長迅速，逐漸呈腹型肥胖，至24周，小鼠精神萎靡，喜臥懶動，反應(yīng)遲緩，毛發(fā)無光澤，造模完成。給予布拉氏酵母菌灌胃干預(yù)后，TB組小鼠體重較前減輕，活動增多，情況好轉(zhuǎn)。實(shí)驗期間， TB

7、組及TD組小鼠各死亡1只，剩余5只，其余組小鼠無死傷發(fā)生。
　　2.實(shí)驗動物體重、肝重指數(shù)的比較
　　MG組較 CG組小鼠體重及肝重指數(shù)顯著增高（P<0.05）；灌胃干預(yù)后，TB組較 TD組體重及肝重指數(shù)顯著降低（P<0.05），但仍明顯高于NG組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.實(shí)驗動物肝臟及末端回腸組織病理
　　肝臟病理：CG組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，大小正常，可見圍繞中央靜脈呈放射狀

8、排列的肝細(xì)胞索，細(xì)胞核大而飽滿，未見脂肪滴及炎性細(xì)胞浸潤；MG組肝細(xì)胞排列疏松、紊亂，脂肪滴呈彌漫性堆積，肝細(xì)胞呈氣球樣變，可見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，點(diǎn)狀壞死。經(jīng)灌胃后， TB組較TD組肝臟脂肪變性程度減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，但與NG組相比其脂肪變及炎癥程度仍較明顯。
　　回腸病理：CG組小鼠末端回腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛及腺體排列整齊，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈高柱狀；MG組小鼠回腸絨毛變疏松，上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死和脫落，間隙增寬，可見上皮

9、層與固有層分離。灌胃干預(yù)后，TB組較TD組黏膜損傷減輕，但仍比NG組損傷嚴(yán)重。
　　4.透射電鏡觀察回腸組織超微結(jié)構(gòu)改變
　　CG組腸黏膜上皮細(xì)胞排列緊密，表面微絨毛豐富，排列規(guī)則，緊密連接比較長，連接縫隙?。籑G組腸黏膜上皮排列較規(guī)則，部分上皮細(xì)胞表面微絨毛倒伏、稀疏，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞。布拉氏酵母菌灌胃后，TB組較TD組上皮細(xì)胞表面微絨毛逐漸豐富，緊密連接結(jié)構(gòu)恢復(fù)，連接縫隙減小，但仍比NG組損傷嚴(yán)重。
　　5.血清生

10、化指標(biāo)比較
　　MG組較CG組血清ALT、AST、TC及TG顯著升高（P<0.05）；灌胃干預(yù)后，與TD組相比，TB組血清ALT、AST、TC及TG顯著降低（P<0.05），但仍高于NG組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.血清LPS水平比較
　　MG組較CG組血清LPS顯著升高（P<0.05）；灌胃干預(yù)后，TB組血清LPS較TD組降低（P<0.05），但仍高于NG組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

11、>　　7.Egr-1、TNF-α在動物肝臟組織的表達(dá)情況
　　應(yīng)用PCR及Western Blot技術(shù)從基因及蛋白水平檢測肝組織中Egr-1、TNF-α表達(dá)，結(jié)果均顯示，MG組Egr-1、TNF-α表達(dá)明顯高于CG組（P<0.05）；灌胃干預(yù)后，TB組表達(dá)量較TD組顯著降低（P<0.05），但仍明顯高于NG組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　8.Occludin、TNF-α在動物末端回腸的表達(dá)情況
　　PCR及

12、Western Blot結(jié)果均顯示：MG組回腸組織Occludin蛋白較CG組表達(dá)降低（P<0.05）；灌胃干預(yù)后，TB較TD組表達(dá)增加（P<0.05），但仍低于NG組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MG組回腸組織中TNF-α較CG組表達(dá)增加（P<0.05）；灌胃干預(yù)后，TB較TD組表達(dá)降低（P<0.05），但仍高于NG組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.西方飲食可誘導(dǎo)NAFLD，NAFLD存在內(nèi)