大鼠ARDS狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭。以肺水腫、呼吸困難、嚴(yán)重低氧血癥為特征性表現(xiàn)，死亡率高達(dá)35-58％[1]，是住院病人后期死亡原因之一。臨床研究表明，急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的患者肺泡內(nèi)液體的早期重吸收是治療關(guān)鍵[4]。因而防治肺水腫是臨床上治療的重點(diǎn)。 內(nèi)皮損傷及肺微血管通透性增高而導(dǎo)致的肺水腫是ARDS重要的病理學(xué)基礎(chǔ)。如何減輕肺上皮損傷，促進(jìn)肺泡內(nèi)

2、液體吸收是防止肺水腫的關(guān)鍵。目前認(rèn)為肺泡上皮細(xì)胞對(duì)鈉水的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是肺泡內(nèi)液體吸收的主要機(jī)制。肺泡上皮細(xì)胞由扁平的Ⅰ型細(xì)胞和立方型的Ⅱ型細(xì)胞組成，主要功能在于清除肺泡內(nèi)多余液體，保持肺泡相對(duì)干燥，維持正常的氣體交換。其中，Ⅱ型細(xì)胞(直徑10mm)除能分泌內(nèi)含板層小體的表面活性物質(zhì)外，還具有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子功能。大量研究證明，肺泡Ⅱ型細(xì)胞頂膜上存在對(duì)鈉離子有通透性的通道膜蛋白。肺泡腔Na+通過(guò)肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞頂膜的鈉通道進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞，再由基

3、底膜的鈉泵(Na+-K+-ATPase)排出到肺循環(huán)中，同時(shí)伴隨水的被動(dòng)吸收[1,3]。 肺泡頂膜鈉通道的活性是鈉水主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的限速環(huán)節(jié)[8]。鈉通道ENaC由三個(gè)蛋白質(zhì)亞基(α-、β-、γ-)組成。三個(gè)亞基以不同的方式組合形成了具有不同生物學(xué)特點(diǎn)和不同調(diào)節(jié)方式的鈉通道[40]。近來(lái)研究報(bào)道鈉離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)受多種信號(hào)分子經(jīng)不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)。如β-腎上腺素受體激動(dòng)劑通過(guò)環(huán)-磷酸腺苷(cAMP)途徑增加鈉通道三個(gè)亞基mRNA水平

4、和鈉通道開放率；流感病毒通過(guò)PLC、Scr途徑激活PKC抑制鈉通道；IL-1β通過(guò)P38MAPK途徑減少鈉通道α-亞基的表達(dá)等[18]。盡管國(guó)外對(duì)鈉轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究愈來(lái)愈重視，但鈉通道生物學(xué)特點(diǎn)及鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確，尤其是ALI/ARDS狀態(tài)下的肺泡上皮鈉通道生物學(xué)特點(diǎn)及調(diào)節(jié)的研究尚不多見。 本研究旨在建立油酸致ARDS模型，觀察ARDS狀態(tài)下急性分離的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉通道三個(gè)亞基mRNA表達(dá)變化，研究β-腎上腺素激

5、動(dòng)劑特布他林介導(dǎo)的鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為ARDS治療提供有效的、可行的方法。 材料和方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體重在180-220g，健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供)。 1、急性分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞鈉通道亞基mRNA表達(dá)及ARDS狀態(tài)下變化 34只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：正常組、ARDS組。每組6只大鼠用于鈉通道亞基RT-PCR檢測(cè)，7只大鼠采用重力法測(cè)定血管

6、外肺水(EVLW)及肺組織病理學(xué)檢查，其余4只備檢其他指標(biāo)。靜脈注射油酸制備ARDS模型。按文獻(xiàn)報(bào)道分離純化肺泡Ⅱ型細(xì)胞。 2、特布他林介導(dǎo)的肺泡Ⅱ型細(xì)胞鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 63只大鼠隨機(jī)分為三組：正常組、ARDS組、特布他林治療組。每組10只大鼠用于放射免疫法測(cè)定肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP，7只大鼠采用重力法測(cè)定血管外肺水(EVLW)和肺組織病理學(xué)檢查，其余4只用于備檢其他指標(biāo)。靜脈注射油酸制備ARDS模型。特布

7、他林治療組大鼠致傷后經(jīng)氣管注入特布他林溶液(0.1mM，5ml/Kg)。三組大鼠均于傷后30分鐘放血活殺。 結(jié)果： 1、ARDS模型的制備 ARDS組大鼠靜脈注入油酸(0.1ml/kg)后，大鼠的呼吸頻率增加、淺促，130-140次/分，口唇、四肢明顯發(fā)紺。動(dòng)脈血?dú)饨Y(jié)果顯示PH(7.13±0.08)、PO2(58.14±5.00)mmHg顯著低于對(duì)照組(P<0.001)。肺組織HE染色ARDS組可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)

8、出血及炎性細(xì)胞，肺泡隔增寬，肺間質(zhì)滲液明顯，局灶的肺泡塌陷和肺不張(圖2-6)。Smith肺損傷評(píng)分(P<0.001)和EVLW(P=0.003)顯著性增高。ATⅡ細(xì)胞電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞變性、崩解，表面的微絨毛減少，胞核變形，胞漿內(nèi)各種細(xì)胞器顯著減少，板層小體排空增多，空泡化，并可見脫落的板層小體。 2、大鼠ATⅡ細(xì)胞ENaCα-、β-、γ-亞單位mRNA表達(dá) ARDS組大鼠ATⅡ細(xì)胞ENaCα-亞基mRNA

9、表達(dá)(5.2150±1.5335)較正常組(7.8303±1.5466)顯著下降(P=0.015)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β-亞基mRNA表達(dá)(1.7005±0.6343)與正常組(2.1947±0.4181)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.147)；γ-亞基mRNA表達(dá)(2.4862±0.6770)與正常組(3.0183±1.3229)相比差異無(wú)顯著性(P=0.408)。 α-亞基mRNA含量在三個(gè)亞基中最豐富，β-亞基、γ-亞基含量相比無(wú)

10、顯著性差異(P=0.253)。 3、特布他林對(duì)肺組織病理?yè)p傷、EVLW和血?dú)夥治龅挠绊?特布他林治療組大鼠肺組織HE染色肺組織充血，少量滲出，肺泡膈輕度增寬，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷程度較ARDS組輕；Smith肺損傷評(píng)分(4.30±0.49)顯著低于ARDS組(7.60±0.81，P<0.001)，但仍高于正常組(1.07±1.18，P<0.001)，有顯著性差異；EVLW(0.6614±0.0729)ml/g低于ARDS組(

11、0.8029±0.1657，P=0.041)，但仍高于正常組(0.5186±0.1034，P=0.039)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。動(dòng)脈血?dú)夥治?，PH(7.13±0.08)、P02(61.44±4.92)mmHg較ARDS組差異無(wú)顯著性(P>0.05)；Pc02(47.95±3.76)mmHg與ARDS組相比有顯著性差異(P=0.010)。 4、特布他林對(duì)肺泡Ⅱ型細(xì)胞的影響 特布他林組見Ⅱ型細(xì)胞相對(duì)不規(guī)則，細(xì)胞變性、凋亡，表面微絨

12、毛減少，胞漿內(nèi)線粒體腫脹，板層小體排空、空泡化程度較ARDS組明顯輕。 5、特布他林介導(dǎo)的肺泡Ⅱ型細(xì)胞鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ARDS組大鼠ATⅡ細(xì)胞內(nèi)cAMP(17.246±3.913)pmol/ml較正常組(34.826±4.626)pmol/ml顯著下降50.4％(P<0.001)；特布他林治療后，cAMP(24.448±4.799)pmol/ml，較ARDS組顯著性升高(P=0.001)。 ARDS組大鼠AT

13、Ⅱ細(xì)胞內(nèi)cGMP(2.486±0.444)pmol/ml較正常組(1.849±0.295)pmol/ml顯著性升高(P=0.001)；特布他林刺激后，cGMP(2.457±0.406)pmol/ml與ARDS組無(wú)顯著性差異(P=0.867)，但與正常組相比仍有顯著性差異(P=0.002)。 結(jié)論： 1、靜脈注射油酸制備ARDS模型成型快，肺部病理改變典型，復(fù)制成功率高。 2、鈉通道三個(gè)亞基在大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞膜上均