EDAG調控GATA-1穩(wěn)定性及紅系分化的作用研究.pdf

1、紅系分化相關基因（EDAG）是造血組織特異表達的轉錄調節(jié)因子，參與調控造血細胞的增殖、分化和凋亡，在造血譜系分化平衡的過程中發(fā)揮關鍵作用，但目前對其發(fā)揮功能的作用機制研究不尚清楚。本論文以蛋白質相互作用為基礎，深入研究了EDAG與紅系/巨核轉錄因子GATA-1及血液腫瘤標志物蛋白質NPM1的相互作用，探討EDAG對造血系統(tǒng)和白血病發(fā)生的作用機制。
　　本研究發(fā)現(xiàn)EDAG是一個新的GATA-1相互作用蛋白質，證實EDAG與GATA-

2、1存在相互作用，并確定了它們相互作用的結構域。進一步的研究發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中過表達EDAG能夠增強GATA-1的穩(wěn)定性，延長GATA-1蛋白質的半衰期。構建過表達和敲低EDAG蛋白質的K562細胞穩(wěn)定株，證明在CHX和PMA處理的過程中EDAG能夠穩(wěn)定內源GATA-1的蛋白質水平，降低GATA-1降解。進一步研究發(fā)現(xiàn)EDAG能夠增強GATA-1的轉錄活性，提高GATA-1的DNA能力。在Epo誘導CD34+細胞向紅系分化的過程中，

3、EDAG能夠穩(wěn)定內源的GATA-1蛋白質水平，EDAG敲低抑制HSP70入核促進GATA-1被caspase3切割，并且抑制紅系分化。
　　NPM1是與白血病發(fā)生密切相關的核仁蛋白，本實驗室前期發(fā)現(xiàn)EDAG與NPM1存在相互作用，初步研究表明EDAG可能調控NPM1蛋白質穩(wěn)定性。本研究使用Co-IP的方法確定了NPM1與EDAG相互作用結構域在NPM1的118-187aa。在CHX的處理下K562細胞過表達EDAG提高NPM1蛋白

4、質穩(wěn)定性，用慢病毒感染的方法敲低EDAG則促進NPM1蛋白質的降解。在PMA誘導K562細胞向紅系分化的過程中過表達EDAG阻止NPM1蛋白質的下調，敲低EDAG后加速NPM1蛋白質下調。初步的實驗表明EDAG可抑制NPM1的泛素化。對EDAG穩(wěn)定NPM1蛋白質的生物學意義研究發(fā)現(xiàn)，在K562細胞中敲低EDAG后增加了由imatinib誘導的細胞凋亡，NPM1過表達則阻止凋亡的增加。這些結果表明EDAG通過與NPM1的相互作用增強NPM

5、1蛋白質的穩(wěn)定性，EDAG可能在白血病細胞抗凋亡的過程中發(fā)揮著關鍵的作用。
　　此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EDAG是p300的新底物，EDAG可被p300催化發(fā)生乙?；揎?；通過免疫沉淀聯(lián)合質譜的方法確定EDAG存在3個乙?；稽c(K189,K327,K341)；乙?；稽c突變能夠增強EDAG自身穩(wěn)定性，促進EDAG與GATA-1之間的相互作用。
　　綜上，我們發(fā)現(xiàn)EDAG可通過穩(wěn)定GATA-1穩(wěn)定性調控紅系分化，并通過調控NPM1