YKL-40誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT效應(yīng)及誘導(dǎo)HMGB-1表達(dá)的研究.pdf

1、背景和目的:YKL-40是一種進(jìn)化上高度保守的缺乏甲殼素酶活性的甲殼素酶蛋白家族成員之一，是新近發(fā)現(xiàn)的炎癥因子。近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)YKL-40蛋白在炎癥、組織重塑的病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，以氣道重塑為主要病理學(xué)特征之一。目前證實(shí)YKL-40與支氣管哮喘發(fā)病過程中的氣道重構(gòu)有密切關(guān)系。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是氣道重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制之一。有報(bào)道指出上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的這一病理狀態(tài)能夠促進(jìn)肺纖維化和哮喘氣道重構(gòu)的發(fā)生

2、。那么，YKL-40能否誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)樣細(xì)胞改變，從而進(jìn)一步促進(jìn)氣道重構(gòu)發(fā)生、發(fā)展，有待進(jìn)一步的研究、探索。
　　HMGB-1是一種非組蛋白，屬于“損傷相關(guān)模式分子”(DAMP)家族的一員，細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)可觸發(fā)HMGB-1的主動或被動釋放。近年來，HMGB-1與支氣管哮喘發(fā)病的相關(guān)性得到越來越多的研究證實(shí)。
　　支氣管哮喘的發(fā)病具體機(jī)制尚不得而知。由于YKL-40和HMGB-1這兩種物質(zhì)都是哮喘發(fā)病過程中的重

3、要調(diào)節(jié)因子，它們之間可能存在某種聯(lián)系，從而共同參與哮喘的發(fā)病過程。因此，本課題的主要研究目的是了解YKL-40蛋白在體外對支氣管上皮細(xì)胞（Beas-2B細(xì)胞）的影響，探討其能否誘導(dǎo)Beas-2B細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT效應(yīng))，同時(shí)明確其能否促進(jìn)Beas-2B細(xì)胞表達(dá)和分泌HMGB-1。
　　方法:我們體外成功復(fù)蘇并培養(yǎng)了人支氣管上皮細(xì)胞(Beas-2B細(xì)胞)，以用來探討YKL-40誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT效應(yīng)和HMGB-1

4、的作用關(guān)系;用不同濃度的YKL-40蛋白刺激Beas-2B細(xì)胞24h后，在倒置顯微鏡下觀察Beas-2B細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測并比較細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)相關(guān)的標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、α-SMA的熒光強(qiáng)弱變化;后進(jìn)一步采用Western-Blot法檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Desmin的蛋白表達(dá)水平;另外，Beas-2B細(xì)胞接受不同

5、濃度的YKL-40蛋白刺激12h后，采用Real-time RT-PCR法測定細(xì)胞提取蛋白中的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Desmin的mRNA表達(dá)水平。后為進(jìn)一步研究YKL-40對HMGB-1的影響，我們分別采用Elisa、real-time RT-PCR和Western-Blot法檢測不同濃度的YKL-40作用于Beas-2B后HMGB-1的表達(dá)情況。
　　按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求配制多種不同濃度的Y

6、KL-40蛋白溶液，并充分混勻，分別于六孔板每孔中加入一定體積濃度為1μg/mL的YKL-40蛋白使得各孔的終濃度分別為0ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和400 ng/mL，混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)24h。收集各孔培養(yǎng)液上清、細(xì)胞裂解液，并分別予以詳細(xì)注明、命名后待用。隨后采用Elisa方法檢測上清HMGB-1水平;采用Western Blot法檢測HMGB-1、E-cadherin、N-cadherin、Vim

7、entin和Desmin的蛋白表達(dá)水平;同時(shí)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測 HMGB-1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Desmin的mRNA表達(dá)水平;細(xì)胞免疫熒光染色法觀察細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和α-SMA的熒光強(qiáng)弱變化。同時(shí)在倒置顯微鏡下可以觀察各組不同濃度的YKL-40作用下支氣管上皮細(xì)胞(Beas-2B)的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:我們在顯微鏡下觀察到

8、，Bease-2B細(xì)胞受到不同濃度的YKL-40蛋白刺激后，其上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)轉(zhuǎn)化，多數(shù)細(xì)胞由原來的上皮細(xì)胞“鋪路石樣”形態(tài)轉(zhuǎn)化為梭形、紡錘體形的間質(zhì)細(xì)胞改變;同時(shí)，細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果表明，YKL-40能夠上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、α-SMA、Vimentin的表達(dá)，而上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)則呈降低趨勢;隨后的RT-PCR和Western-Blot實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了上述的結(jié)果，以上結(jié)果說明YKL-4