抗Aβ12-35納米抗體的制備及活性研究.pdf

1、阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚沒(méi)有定論，很多研究表明Aβ及其聚集體是AD發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，因此研發(fā)能夠針對(duì)Aβ聚集體的抑制劑或藥物成為越來(lái)越受到關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。在基于抗Aβ抗體治療AD的方法中，目前多采用人源化多克隆或單克隆抗體和小分子單鏈抗體等，與之相比，納米抗體由于制備成本低、容易跨越血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)，在抗體療法中受到越來(lái)越多的研究和關(guān)注。另外，已有的研究

2、表明，Aβ的氮端不參與Aβ的聚集，用于臨床實(shí)驗(yàn)的能夠識(shí)別Aβ氮端的抗體因?yàn)槟芤饳C(jī)體更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)而不得不停止臨床實(shí)驗(yàn);而Aβ中間片段是與Aβ聚集相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)以及毒性片段，極易形成β折疊結(jié)構(gòu)，而β折疊正是Aβ聚集體主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能夠識(shí)別Aβ聚集區(qū)段的抗體的炎癥反應(yīng)相對(duì)較低，因此，篩選能夠特異性結(jié)合Aβ中間段的納米抗體對(duì)于抑制Aβ的聚集和探索Aβ聚集機(jī)制將具有重要意義。本論文選擇Aβ肽全長(zhǎng)的中間段Aβ12-35作為抗原，篩選其納米抗體

3、，并通過(guò)E.coli表達(dá)系統(tǒng)制備納米抗體，并探討了其對(duì)Aβ聚集能力的影響。本論文研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)納米抗體基因序列的篩選。以Aβ12-35單體作為抗原，通過(guò)抗原的定點(diǎn)固載，利用噬菌體展示庫(kù)技術(shù)，經(jīng)過(guò)4輪淘選，ELISA測(cè)定親和活性，從Aβ42噬菌體免疫庫(kù)中篩選得到DP4、DP6、DP18和DP36四種納米抗體基因序列。
　　(2)納米抗體的表達(dá)純化。通過(guò)PCR擴(kuò)增、雙酶切等方法將4種納米抗體基因克隆到表達(dá)載體pET2

4、3a;重組質(zhì)粒在宿主菌E.coli Shuffle T7和E.coli Origami2(DE3)中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。純化后其純度均能達(dá)到90％以上。經(jīng)ELISA活性檢測(cè)，S-DP4，O-DP4，S-DP6，O-DP6表現(xiàn)出較好的抗原結(jié)合活性。Biacore測(cè)定其親和常數(shù)，S-DP6親和常數(shù)最高，約為10-7，其他三種親和常數(shù)在10-6，結(jié)果與ELISA基本相符。
　　(3)納米抗體的功能研究。ELISA結(jié)果表明，納米抗體S-DP