外源性硫化氫通過調(diào)控瘦素-瘦素受體-JAK-STAT通路抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一章 外源性硫化氫通過調(diào)控瘦素/瘦素受體通路抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　中國糖尿病患者人數(shù)眾多，目前已超過1億人，糖尿病的主要危害在于其慢性并發(fā)癥。高血糖是糖尿病的一個(gè)重要特征，是引起糖尿病幾乎所有并發(fā)癥（如大血管病變、微血管病變、神經(jīng)病變等）最為直接的因素。高血糖可通過多種病理生理機(jī)制，如引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷等，導(dǎo)致糖尿病的多種并發(fā)癥。
　　瘦素(leptin)

2、是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的激素，通過瘦素受體(LEPR)發(fā)揮其生物活性。作為細(xì)胞因子，瘦素可以發(fā)揮多種生物效應(yīng)，如調(diào)控炎癥、繁殖和血管生成。瘦素/瘦素受體信號(hào)通路已在許多系統(tǒng)在生化和分子水平上被廣泛研究。新近證據(jù)表明，瘦素可能是一個(gè)潛在的糖尿病血管病變治療的新靶點(diǎn)。
　　硫化氫(H2S)是一種新型的氣體信號(hào)分子。生理濃度的H2S對(duì)多種細(xì)胞有保護(hù)作用，由于具有抗氧化和對(duì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，近年來H2S在糖尿病血管病變的治療作用吸

3、引了學(xué)者們的研究興趣。但是，外源性H2S能否通過調(diào)控瘦素/瘦素受體通路抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚未明了。
　　目的：
　　1.探討瘦素/瘦素受體通路是否介導(dǎo)高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的損傷;
　　2.H2S能否通過調(diào)控瘦素/瘦素受體通路抑制高糖所致的HUVECs損傷。
　　方法：
　　1.應(yīng)用40mmol/L葡萄糖作用于HUVECs24h建立高糖(HG，40mmol/Lglucose)損傷

4、內(nèi)皮細(xì)胞模型;
　　2.應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測試劑盒（CCK-8）檢測細(xì)胞存活率;
　　3.Western Blot法測定瘦素和瘦素受體蛋白的表達(dá)水平;
　　4.Hoechst33258核染色熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs凋亡的形態(tài)學(xué)與數(shù)量改變;
　　5.雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡照相法檢測胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;
　　6.羅丹明123(Rh123)染色熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs線粒體膜

5、電位(MMP)水平。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用40mmol/L葡萄糖分別作用于HUVECs3～24h，3h開始明顯上調(diào)瘦素的表達(dá)水平，于9h時(shí)瘦素表達(dá)水平最高(p＜0.01);
　　2.應(yīng)用40mmol/L葡萄糖分別作用于HUVECs3～24h，3h開始明顯上調(diào)瘦素受體的表達(dá)，于9h時(shí)瘦素受體表達(dá)水平達(dá)到峰值(p＜0.01);
　　3.應(yīng)用400umol/L硫氫化鈉(NaHS，為H2S的供體)預(yù)處理HUVECs3

6、0min能抑制高糖對(duì)瘦素表達(dá)水平的上調(diào)作用(p＜0.01);
　　4.應(yīng)用400umol/L NaHS預(yù)處理HUVECs30min能抑制高糖對(duì)瘦素受體表達(dá)水平的上調(diào)作用(p＜0.01);
　　5.應(yīng)用400umol/L NaHS預(yù)處理HUVECs30min可明顯地減輕高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷，提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡數(shù)量，減少胞內(nèi)ROS堆積及MMP丟失(p＜0.01);
　　6.應(yīng)用50ng/ml瘦素拮抗劑(LA

7、)預(yù)處理HUVECs1h也能產(chǎn)生與NaHS相似的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，使細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡減少，胞內(nèi)ROS堆積及MMP丟失減少(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.瘦素/瘦素受體通路介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷;
　　2.外源性H2S通過抑制瘦素/瘦素受體通路對(duì)抗高糖導(dǎo)致的HUVECs損傷。
　　第二章 硫化氫通過調(diào)控JAK/STAT通路抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷
　　在第一章中，已經(jīng)證實(shí)H

8、2S可通過抑制瘦素/瘦素受體通路對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷。
　　Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/Signal transducer andactivator of transcription，JAK/STAT)通路是最早被確認(rèn)且最為重要的瘦素下游信號(hào)通路。瘦素與其受體結(jié)合后，改變其受體的構(gòu)型，繼而激活JAK蛋白(主要是JAK2)，被激活的JAK2再激活STAT（STAT3）通路。有研究指出，

9、JAK/STAT通路參與瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。還有人報(bào)道，高糖可通過激活JAK/STAT通路引起糖尿病腎病。但是，JAK/STAT通路是否介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚未明了，相關(guān)研究較少，值得探討。
　　目的：
　　1.探討JAK/STAT通路是否介導(dǎo)高糖對(duì)HUVECs的損傷;
　　2.H2S能否通過調(diào)控JAK/STAT通路抑制高糖所致的HUVECs損傷。
　　方法：
　　1.應(yīng)用40mmol/L葡萄

10、糖作用于HUVECs24h建立高糖(HG，40mmol/Lglucose)損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型;
　　2.應(yīng)用CCK-8檢測細(xì)胞存活率;
　　3.Western Blot法測定磷酸化(p-)JAK2及p-STAT3蛋白的表達(dá)水平;
　　4.Hoechst33258核染色熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs凋亡的形態(tài)學(xué)與數(shù)量改變;
　　5.DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法檢測胞內(nèi)ROS水平;
　　6.Rh123染色

11、熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs的MMP水平。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用400umol/L NaHS預(yù)處理HUVECs30min能抑制高糖對(duì)p-JAK2表達(dá)的上調(diào)作用(p＜0.01);
　　2.應(yīng)用400umol/L NaHS預(yù)處理HUVECs30min能抑制高糖對(duì)p-STAT3表達(dá)的上調(diào)作用(p＜0.01);
　　3.應(yīng)用400umol/L NaHS預(yù)處理HUVECs30min可明顯地減輕高糖誘導(dǎo)的HUVECs

12、損傷，使細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，胞內(nèi)活性氧(ROS)堆積及MMP丟失減少(p＜0.01）;
　　4.應(yīng)用20μmol/L JAK/STAT通路抑制劑(AG490)預(yù)處理HUVECs30min也能起到與NaHS相似的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，能提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡，減少胞內(nèi)ROS堆積及MMP丟失(p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.JAK/STAT通路介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷;
　　2.H2S通