西達本胺下調(diào)EZH2-Hedgehog信號通路增強急性白血病細(xì)胞株KasumI-1對化療藥物敏感性.pdf

1、研究目的:
　　急性髓細(xì)胞白血病(AML)是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，預(yù)后差，易復(fù)發(fā)或演變?yōu)殡y治性AML，耐藥是AML復(fù)發(fā)及難治的重要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的耐藥與表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)有關(guān)，西達本胺(CS055)是組蛋白去乙?；敢种苿?，研究發(fā)現(xiàn)CS055能通過抑制HDAC以增加組蛋白的乙酰化、降低組蛋白甲基化水平來引發(fā)染色質(zhì)重塑，由此改變多條信號傳遞通路，進而恢復(fù)耐藥細(xì)胞對藥物的敏感性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AML細(xì)胞株Kasumi-

2、1對阿霉素(ADM)及阿糖胞苷耐藥，同時證實了沉默EZH2后通過抑制Hedgehog通路體活性外能增加Kasumi-1細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
　　本實驗旨在探討CS055體內(nèi)外是否能增加Kasumi-1細(xì)胞對化療藥物的敏感性，同時研究其逆轉(zhuǎn)耐藥機制。
　　研究方法:
　　1.CS055對急性白血病細(xì)胞株Kasumi-1增殖及凋亡影響:用CCK-8(cellcounting kit-8)法測不同濃度的CS055作用不同

3、時間對Kasumi-1細(xì)胞增殖活性的影響。流式細(xì)胞術(shù)測不同濃度的CS055處理Kasumi-1細(xì)胞48h凋亡情況。
　　2.CS055增加急性白血病細(xì)胞株Kasumi-1對化療藥物的敏感性:CCK-8法檢測ADM及CS055聯(lián)合ADM作用24h后對Kasumi-1細(xì)胞增殖活性的影響，并計算出逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)測CS055、ADM單藥及聯(lián)合用藥處理Kasumi-1細(xì)胞24h凋亡情況。
　　3.CS055下調(diào)EZH2/He

4、dgehog通路:用Western blot檢測CS055作用Kasumi-1細(xì)胞48h后EZH2、G1i-1、Smo、DNMT3A、Acetyl-H3、H3K27me3等蛋白的表達變化。
　　4.CS055對裸鼠移植瘤化療增敏作用:培養(yǎng)Kasumi-1、Si-EZH2 Kasumi-1細(xì)胞，以1×107個細(xì)胞/只接種于6周齡BALB/c裸鼠皮下，瘤體大小約150-200mm3，將Kasumi-1細(xì)胞的荷瘤裸鼠隨機分4組:空白對照

5、組、ADM組、CS055組、CS055聯(lián)合ADM組，Si-EZH2 Kasumi-1細(xì)胞的荷瘤裸鼠分為空白對照組、ADM組。每日測量裸鼠腫瘤長短徑并計算腫瘤體積。第10天處死荷瘤鼠，手術(shù)摘除腫瘤稱重，免疫組化研究信號蛋白表達水平。
　　5.免疫組化觀察裸鼠移植瘤通路信號蛋白表達:將腫瘤組織石蠟切片，免疫組化觀察各組EZH2、Gli-1、Smo、p-AKT、MRP1表達水平。
　　6.統(tǒng)計分析:采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)

6、分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗或非參數(shù)檢驗，多組均數(shù)比較用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗，多重比較分析若方差齊則采用Bonferroni方法，方差不齊則使用近似F檢驗分析后采用Dunnett's T3方法， P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.CS055對Kasumi-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，不同濃度CS055對Kasumi-1細(xì)胞具有生長抑制作用，隨處理時間延長和藥物劑量增

7、加，細(xì)胞增殖抑制率提高，呈明顯的時間一劑量依賴關(guān)系。與之相應(yīng)，細(xì)胞總凋亡率隨著藥物濃度的增加也逐漸增加，單因素方差分析顯示，不同藥物濃度處理Kasumi-1細(xì)胞48h細(xì)胞總凋亡率之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=88.09; P=0.000)。
　　2.CS055逆轉(zhuǎn)Kasumi-1細(xì)胞的耐藥作用
　　CCK8法檢測結(jié)果顯示，CS055能夠提高ADM對Kasumi-1細(xì)胞的增殖抑制作用，聯(lián)合組IC50濃度為0.301±0.082μg/

8、ml，明顯低于ADM單藥組（2.421±0.045μg/ml），其逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為8.1倍。凋亡結(jié)果顯示， CS055明顯提高ADM對Kasumi-1細(xì)胞的凋亡率，其總凋亡率43％，明顯高于空白組、CS055組和ADM組(P=0.000)。
　　3.CS055下調(diào)EZH2/Hedgehog通路活性
　　CS055處理Kasumi-1細(xì)胞48 h，Western blot結(jié)果顯示Acetyl-H3表達量明顯升高，而EZH2及EZ

9、H2調(diào)節(jié)蛋白DNMT3A、H3K27me3表達下降，同時伴隨其下游Hedgehog相關(guān)蛋白Smo、Gli-1表達水平明顯降低。
　　4.移植瘤瘤體變化
　　體內(nèi)實驗結(jié)果表明，Kasumi-1 CS055組、Si-EZH2 Kasumi-1 ADM組、Kasumi-1 CS055聯(lián)合ADM組腫瘤細(xì)胞生長速度及瘤體重量明顯低于Kasumi-1Control組、Kasumi-1 ADM組及Si-EZH2 Kasumi-1 Cont

10、rol(P＜0.001)，同時Kasumi-1 CS055聯(lián)合ADM組腫瘤生長速度及瘤重低于Kasumi-1 CS055組(P＜0.05)。
　　5.免疫組化檢測每組腫瘤組織各蛋白信號表達:
　　結(jié)果顯示CS055處理后，組織中EZH2、Smo、Gli-1、p-AKT、MRP1表達下降，同時沉默EZH2后Smo、Gli-1、p-AKT、MRP1蛋白表達量也明顯下降。
　　研究結(jié)論:
　　1.CS055對Kasum